Елективні живильні середовища приклади. Поживні середовища. Сахаронітратний агар Чапека-Докса

Елективні середовища були введені в мікробіологічну практику С.М.Виноградським та М.Бейєрінком. Це такі живильні середовища, у яких шляхом додавання однієї або кількох хімічних сполук, створюються оптимальні умови для зростання та розмноження одного виду мікроорганізмів (або групи споріднених мікроорганізмів) та несприятливі – для решти. Такі середовища застосовуються головним чином виділення чистої культури мікроорганізмів з місць їх природного проживання і накопичення маси культур (хімічний метод виділення чистої культури). Наприклад, живильне середовище, яке являє собою згорнуту кінську сироватку, є елективним середовищем для дифтерійних бактерій, лужна пептона вода - для холерних вібріонів, жовчний бульйон - для збудника черевного тифу, печінковий бульйон - для бруцел і т.д.

Накопичення мікробів в елективних поживних середовищах у багатьох випадках служить важливим попереднім етапом при виділенні чистих культур з вихідних досліджуваних матеріалів (наприклад, холерного вібріона або черевнотифозних бактерій з випорожнень хворих або носіїв тощо).

Що Ви розумієте під дифіринцально-живильним середовищем?

Диференціально - діагностичні середовища - це такі середовища, до складу яких крім речовин, що забезпечують зростання та розвиток мікроорганізмів, входять речовини, що застосовуються як субстрат для певних ферментів. За якісною зміною субстрату Визначається присутність того чи іншого ферменту (оцінюється за допомогою індикатора, що реагує на наявність у живильному середовищі продуктів розпаду субстрату).

Кожен вид мікроорганізмів характеризується досить стабільним набором ферментів. Визначення набору ферментів з допомогою диференціально – дагностических середовищ дозволяє диференціювати види мікроорганізмів. Наприклад, кров'яний агар дозволяє виявити фермент гемолізин, середовища Гіса – цукролітичні ферменти (карбогідрази), желатин використовується для врахування протеолітичних властивостей мікробів тощо.

Кров'яний агар. Про наявність ферменту гемолізину судять щодо руйнування еритроцитів та утворення світлої зони навколо мікробів, що виросли на кров'яному агарі.

Середовища Гіса. Про наявність ферментів – карбогідраз, що розщеплюють вуглеводи до кислоти, свідчить зміна рН середовища в кислу сторону та зміна кольору живильного середовища. Відмінність у наборі ферментів може бути використана для перевірки чистоти культури, що виділяється, а також для швидкої диференціювання одного виду від інших при первинному дослідженні посівів заразного матеріалу.

Хімічні реактиви

1. Що таке хімічні реактиви та для чого вони застосовуються?

Реактиви хімічні- Речовини, що використовуються в лабораторній практиці для здійснення різних хімічних реакцій.

Найчастіше хімічні реактиви є індивідуальними речовинами, проте часто вони мають складний склад. Загальноприйнятої класифікації хімічних реактивів немає, найчастіше їх ділять на аналітичні хімічні реактиви інше.

2. У ветеринарії, з якою метою вони використовуються?

В ветеринарії хімічні реактиви використовуються для аналітичних та діагностичних цілей у клінічних, ветеринарно-санітарних, гігієнічних, експертизних, біохімічних та інших лабораторних дослідженнях. Методи досліджень, що застосовуються та розробляються біологічною та клінічною практикою, вимагають великого асортименту хімічних реактивів, які повинні задовольняти найрізноманітнішим вимогам. Наприклад, для клінічних та біохімічних досліджень необхідні високоочищені субстрати для ферментів, самі ферменти, реагенти на специфічні групи (SH, NH3, СООН – групи та ін) тощо. Для проведення неорганічних та органічних синтезів, а також при якісному та кількісному аналізах, в т.ч. при ветеринарно-санітарному контролі в різних виробництвах, аналізі) лікарських засобів, при проведенні ветеринарних, санітарно-гігієнічних аналізів харчових продуктів, повітря, води і т.д. використовують велику кількість найрізноманітніших хімічних реактивів високого ступеня очищення.

Цукровий бульйон та цукровий агарготують шляхом додавання до звичайного бульйону або розплавленого простого агару того чи іншого вуглеводу від 0,5 до 1%. Вуглевод розчиняють у невеликій кількості води, а потім додають до живильного середовища. Стерилізацію цукрового бульйону та агару виробляють в апараті Коха 3 дні поспіль по 1 годині.
Агар з кров'ю, сироваткою або з асцитичною рідиноюготують при дотриманні суворої асептики. До готового слабо-лужного розплавленого і знову охолодженого до 45° агару, розлитого в пробірки або флакони, додають 20-25% стерильної сироватки або асцитичної рідини або 5-25% стерильної крові дефібринованої. Після ретельного перемішування (уникати утворення пухирів та піни) агар у пробірках скошують, а вміст флаконів розливають по чашках Гейденрейха. Бульйон із сироваткою, асцитичною рідиною або кров'юготують таким самим способом, як агар, але без нагрівання. Для контролю стерильності бульйон ставлять термостат на 48 годин при 37°.

Диференціально-діагностичні живильні середовища. Склад та призначення.

Середовище Ендо.Готується безпосередньо перед вживанням. До 100 мл м'ясо-пептонного агару або агару на бульйоні Хоттингера (pH 7,6) стерильно додають 1 г хімічно чистої лактози, розчиненої в 5 мл стерильної води, охолоджують до 70° і додають суміш 0,5 мл насиченого розчину основного 1 25 мл свіжоприготовленого 10% розчину сірчистокислого натрію, збовтують і розливають по чашках. Для підсушування відкриті чашки поміщають на 30 хвилин термостат при 37°.

На середовищі Ендо кишкова паличка дає колонії червоного кольору з металевим відтінком, а бактерії тифозно-паратифозної та дизентерійної групи – безбарвні колонії.

Строкатий ряд вуглеводів (середа Гісса).До 100 мл води додають 1 г пептону, 0,5 г кухонної солі. Пептон і сіль розчиняють у гарячій воді протягом декількох хвилин і фільтрують через паперовий фільтр (розчин має бути повністю прозорим). Встановлюють pH 7,0. У зазначеному середовищі розчиняють 1% одного з застосовуваних вуглеводів, на дно пробірок опускають поплавці для уловлювання газу (що свідчить про глибоке розщеплення цукрів) і додають індикатор. Як індикатор використовують:

а) лакмусову настойку – 5 мл на 100 мл середовища. У кислому середовищі лакмусова настойка показує почервоніння, у лужному – посиніння;

б) азолітмін, який є очищеним препаратом лакмусу, його калійною сілью (на 1 л середовища додають 0,25 г азолітміну);

в) бромтимол блау - на 1 л середовища 1 мл 1,6% спиртового розчину індикатора (середовище набуває зеленого кольору, синіє при утворенні лугу, жовтіє при утворенні кислоти);

г) індикатор Андреде, який складається з 1 г кислого фуксину, 400 мл дистильованої води та 64 мл нормального розчину їдкого натру. До живильного середовища додають 1% індикатора. Середовище у пробірці має придбати солом'яно-жовтий колір без рожевого відтінку. У кислому середовищі колір середовища змінюється червоний.

Індикатор додають у тому, щоб визначити зміни реакції живильного середовища, що відбувається під впливом ферментації вуглеводів, т. е. виявлення біохімічної активності мікробів. Останнє має велике значення для мікробіологічної діагностики низки інфекційних захворювань (черевний тиф, дизентерія, холера та ін.). Середовище з вуглеводами та індикатором розливають у стерильні пробірки та стерилізують дробово при 100° протягом 3 днів.

Короткий строкатий ряд. Зміна у разі зростання E. coli, S. typhi.

Методи виділення чистих культур аеробів.

Метод Дрігальського

Виділення чистої культури анаеробів.

Див пракнавики

Вірусологічні методи. Призначення, принцип.

Вірусологічний метод

Основні етапи:

1. Забір досліджуваного матеріалу.

2.Вибір за принципом цитотропізму та отримання чутливої ​​тест-системи, визначення її життєздатності.

3. Зараження вибраної системи.

4.Індикація вірусу на підставі виявлення його нуклеїнової кислоти, антигенів, гемаглютиніну, ЦПД, включень.

5. Ідентифікація та титрування вірусу проводиться на підставі:

а) визначення антигенів вірусу за допомогою імунологічних реакцій (РІФ, ІФА, РПГА, РСК, РН, ВІЕФ та ін.); б) патогістологічного дослідження органів та тканин; в) ЦПД; г) клінічних симптомів, біологічних проб (кератоконьюнктивальна та ін.).

Методи індикації вірусів

При зараженні вірусами клітинних культур можна отримати різні видимі прояви дії вірусу:

1. Цитопатична дія вірусу на культуру клітин (ЦПД)– виникнення у ній видимих ​​морфологічних дегенеративних змін;

2. Придбання зараженої культурою клітин здатності до гемадсорбції- до адсорбції еритроцитів на поверхні клітинного шару;

3. Освіта в зараженій клітинній культурі під щільним шаром спеціального агарового покриття характерних бляшок, що є «негативними колоніями» вірусів;

4. Внутрішньоклітинні включення

Засоби для вирощування анаеробних мікробів.М'ясопептонний бульйон печінковий Кіта - Тароцці (МППБ).Свіжу або заморожену печінку (краще великої рогатої худоби) ріжуть на дрібні шматки, заливають рівною масою кількістю водопровідної води, варять протягом години, фільтрують через вату і додають до 1 частини отриманого екстракту 3 частини м'ясопептонного бульйону. Суміш нагрівають до кипіння, додають хімічно чисту кухонну сіль (на 1 л 1,25 г) і доводять рН до 7,6-7,8, після чого кип'ятять протягом 15 хв і фільтрують через паперовий або зволожений ватний фільтр. До профільтрованого бульйону додають дрібно нарізані шматочки (по 1,5-2 г) печінки, з розрахунку на 1 л бульйону 100 г печінки (печінка попередньо очищають від плівок і промивають водою). У пробірку поміщають кілька таких шматочків, наливають високим стовпчиком 7-10 мл бульйону, на поверхню його нашаровують вазелінове або парафінове масло.

Бульйон зі шматочками печінки стерилізують під надмірним тиском 0,1 МПа впротягом 30 хв. Для видалення з пробірки кисню перед посівом середу кип'ятять 10 хв і швидко охолоджують водою.

Напіврідкий агар для анаеробів. До МПБ додають 0,25-0,75% агар-агару та 1% глюкози; рН середовища 7,4. Середовище розливають високими стовпчиками у пробірки. Стерилізують дробово плинною парою по 15-20 хв протягом 3 днів.

Засоби для вирощування молочнокислих бактерій.Молоко (цілісне).Нагрівають до кипіння. Наливають у тубусну склянку і ставлять на 10-20 годин у холодне місце для відстоювання вершків. Після цього через кран тубуса розливають знежирену частину молока по пробірках, закривають ватними пробками. Стерилізують дробово при 100 ° С три дні по 20 хв або при 112 ° С одноразово 30 хв.

Обезжирене молоко. Для отримання знежиреного молока незбиране молоко сепарують і далі надходять так само, як при використанні незбираного молока.

Гідролізоване молоко (за Богдановим).Беруть 1 л прокип'яченого іостудженого до 45° З знежиреного молока, встановлюють рН 7,6-7,8, додають 0,5 г порошку панкреатину (розведеного попередньо в невеликій кількості теплої води) або 2-3 г подрібненої підшлункової залози і через кілька хвилин 5 мл хлороформу. Після цього сулію ретельно струшують, щільно закривають корковою пробкою і поміщають на 3 доби в термостат при температурі 40° З при щоденному струшуванні рідини. Після закінчення зазначеного терміну з метою видалення хлороформу сулію відкривають, рідину фільтрують і розбавляють у 2-3 рази водопровідною водою. Доводять рН середовища до 7,0-7,2 і стерилізують.

Агар з гідролізованого молока.До гідролізованого молока додають 1,5-2% агару, розплавляють, розливають пробірками і стерилізують під надлишковим тиском 0,1 МПа впротягом 15 хв. На цьому середовищі добре ростуть молочнокислі палички.

Сироватковий агар. На 100 мл водопровідної води беруть 7,5 г агару, кип'ятять до повного розчинення, додають води до початкового об'єму (тобто в об'ємі, рівному об'єму води, що випарувалася), додають 400 мл заздалегідь приготовленої молочної сироватки, піддають дії текучої пари в 30 хв, фільтрують через шар вати, розливають за пробірками істерилізують під тиском 0,05 МПа протягом 30 хв.

Капустяне середовище. 200 г подрібненої капусти (або люцерни) заливають 100 мл води та кип'ятять у каструлі 10 хв, віджимають через подвійний шар марлі. Отриману рідину фільтрують та розводять у 2 рази водопровідною водою. Додають 2% глюкози та 1% пептону, розливають по пробірках і стерилізують три надмірному тиску 0,05 МПа протягом 15 хв.

Середовище для вирощування осмофільних дріжджів. Приблизно 1 л дистильованої води вносять 200 г попередньо підігрітого меду, 1 г двофосфорнокислого калію, 0,5 г сульфату магнію, 0,5 г виннокислого амонію, 0,1 г хлористого натрію і 0,1 г хлористого калію. Усі компоненти змішують та стерилізують під надлишковим тиском 0,1 МПа протягом 20 хв.

Середовище для вирощування галофілів. Використовують звичайні м'ясопептони з додаванням від 10-15 до 20-30% кухонної солі. Крім того, при виготовленні щільних поживних середовищ збільшують і процентний вміст агару. Стерилізацію проводять під надлишковим тиском 0,1 МПа протягом 20 хв.

Середовища збагачення. Середовище Мюллера. До 4,5 г хімічно чистої крейди, попередньо простерилізованої сухим жаром, додають 90 мл МПБ і стерилізують під надлишковим тиском 0,1 МПа протягом 20 хв. Готують: а) розчин гіпосульфіту (50 г чистого кристалічного гіпосульфіту заливають до 100 мл дистильованою водою, стерилізують плинною парою протягом 30 хв); б) розчин йоду (20 г металевого йоду та 25 г йодистого калію заливають до 100 мл дистильованою водою). Перед посівом до бульйону з крейдою стерильно додають 10 мл розчину гіпосульфіту та 2 мл розчину йоду. При додаванні кожного інгредієнта суміш збовтують. Розливають по стерильним пробіркам чи колбам.

Середа Кілліана. До 100 мл звичайного МПБ стерильно додають перед використанням 1 мл водного розчину (1:1000) алмазного зеленого.

Поживні середовища є основою бактеріологічних досліджень. Вони служать виділення з досліджуваного матеріалу чистих культур мікробів, вивчення їх властивостей. На живильних середовищах створюються оптимальні умови для розмноження мікроорганізмів. До складу середовищ повинні входити речовини, необхідних побудови всіх компонентів цитоплазми, тобто. всі джерела зростання живого організму. Сюди насамперед відносяться джерела азоту, вуглецю, водню та кисню.

Джерело водню та кисню в поживних середовищах – вода. Джерелом азоту є органічні сполуки, які отримують з м'яса, риби, плаценти, молока, яєць, крові. В результаті гідролізу панкреатином або трипсином із цих продуктів виходять т.зв. гідролізати, що містять велику кількість амінокислот та пептонів, які добре засвоюються більшістю мікроорганізмів. Нативний білок засвоюють лише деякі мікроорганізми, що мають екзопротеази. Гідролізати є основою приготування середовищ багатьох мікроорганізмів.

Джерелом вуглецю для патогенних мікробів є головним чином різні вуглеводи: моно- і дисахара, багатоатомні спирти, органічні кислоти та їх солі.

Крім органогенів, бактеріям необхідні неорганічні сполуки, що містять фосфор, калій, сірку, натрій, магній, залізо, а також мікроелементи: кобальт, йод, марганець, бор, цинк, молібден, мідь та ін.

Потреба мікроорганізмів у неорганічних сполуках задовольняється додаванням до живильного середовища солей КН2РO4 К2НРO4 та ін. Поруч із переліченими органічними елементами, багато мікроорганізми потребують чинники зростання, тобто. у речовинах, які вони не можуть синтезувати. Фактори зростання необхідно додавати в живильні середовища у готовому вигляді. До факторів зростання відносяться різні вітаміни, джерелом яких у поживних середовищах є додані до живильного середовища продукти рослинного та тваринного походження, що містять у своєму складі нікотинову, пантотенову, парабензойну кислоти, вітаміни А, В, С та ін.

Поживні речовини мікробами можуть засвоюватися лише за певної реакції середовища, т.к. проникність оболонок мікробних клітин змінюється в залежності від рН середовища.

Вимоги до поживних середовищ.

1. Поживні середовища повинні містити необхідні живлення мікробів поживні речовини.

2. Мати реакцію рН, оптимальну для виду мікроба, що вирощується. -

3. Поживні середовища повинні мати достатню вологість та в'язкість, т.к. мікроби харчуються за законами дифузії та осмосу.

4. Мати ізотонічність і мати певний окисно-відновний потенціал (гН2).

5. Поживні середовища мають бути стерильними, забезпечуючи цим можливість вирощування чистих культур.

Потреба в поживних речовинах та фізичних умовах у різних видів мікробів неоднакова, і цим виключається можливість створення універсального живильного середовища.

По консистенції розрізняють щільні та рідкі живильні середовища. Щільні готують на основі рідких за допомогою додавання до них клейових речовин: агар-агару або желатину! Агар-агар (по-малайськи – желе) – продукт рослинного походження, добувається з морських водоростей. У воді агар-агар розчиняється при температурі 80-86°С, твердне при 36-40 і тому використовується для ущільнення живильних середовищ для вирощування різних груп мікроорганізмів при оптимальній для них температурі.

Класифікація поживних середовищ проводиться за їх складом та призначенням

1.По складу живильні середовища діляться на прості та складні

Розрізняють групу середовищ загального призначення – найпростіших. До цієї групи відносять м'ясо-пептонний бульйон (простий поживний бульйон), м'ясо-пептонний агар (простий поживний агар), поживний желатин. Ці середовища застосовуються вирощування багатьох патогенних мікробів. Середовища загального призначення, або прості живильні середовища, готуються зазвичай із гідролізатів з додаванням пептону та хлористого натрію. Їх використовують також як основу для виготовлення складних середовищ.

2.До другої групи відносяться середовища елективні, спеціальні та диференціально-діагностичні.

Середовища елективні (селективні, вибіркові, накопичення, збагачення). Принцип створення елективних поживних середовищ заснований на задоволенні основних біохімічних та енергетичних потреб того виду мікроба, для культивування якого вони призначені, або додавання інгібіторів, що пригнічують зростання супутньої мікрофлори. Певний склад і концентрація поживних речовин, мікроелементів, ростових факторів при певному значенні pH або додаванні інгібіторів забезпечують оптимальні умови для вирощування одного або декількох видів мікроорганізмів. При посіві на них матеріалу, що містить суміш різних мікробів, насамперед буде пров'ятися зростання того виду, для якого середовище буде елективним. Прикладом елективних середовищ є жовтковий бульйон, селенітовий бульйон, середовище Плоскірєва – для вирощування мікробів сімейства кишкових, лужна пептона вода – для холерного вібріона.

Жовтковий бульйон. До МСЛ додають 10-20% бичачої жовчі. Жовч пригнічує ріст коків та повітряної флори, але сприятлива для розмноження сальмонел.

Селенітовий бульйон. Складається з фосфатного бульйону з додаванням натрієвої солі селеніту, яка є інгібітором росту кокової флори, кишкової палички, але не затримує зростання сальмонел.

Середа Плоскірєва. Щільне середовище, що містить інгібітори кишкової палички, коків, але сприятливе для зростання шигел і сальмонел, розмноження яких не гальмується алмазним зеленим і жовчними солями.

Пептонна вода. Містить 1% пептону та 0,5% хлористого натрію. Середовище є елективним для хлорних вібріонів, т.к. вони краще за інші бактерії розмножуються на "голодних середовищах", особливо при лужній реакції, тому що самі виділяють кислі продукти життєдіяльності.

Спеціальні середовища. Необхідні для культивування бактерій, що не ростуть на простих поживних середовищах. Для деяких організмів до простих поживних середовищ необхідно додавати вуглеводи, кров та ін додаткові поживні речовини. Прикладами простих поживних середовищ є цукровий бульйон і цукровий агар для стрептокока (готується відповідно МПБ і МПА, до яких додається 0,5-2% глюкози).

Для пневмококів і менінгококів спеціальним середовищем є сироватковий бульйон і сироватковий агар (для приготування сироваткового бульйону змішують 1 частину МПБ з 2 частинами свіжої сироватки, для отримання сироваткового агару до розплавленого МПА додається 10-25% стерни)

Диференціально-діагностичні середовища використовують визначення видової приналежності досліджуваного мікроба, виходячи з особливостях його обміну речовин». За своїм призначенням диференціально-діагностичні середовища поділяють так:

1. Середовища виявлення протеолітичної здатності мікробів, що містять у своєму складі молоко, желатин, кров і т.д.

2. Середовища з вуглеводами та багатоатомними спиртами для

виявлення різних цукролітичних ферментів.

До складу диференціально-діагностичних середовищ, призначених для виявлення цукролітичних властивостей та окисно-відновних ферментів, вводять індикатори: нейтральну червону, кислий фуксин, бромтимоловий синій, водний блакитний з рожевою кислотою (ВР). Змінюючи своє забарвлення за різних значень рН, індикатор вказує на наявність ферменту і розщеплення введеного в середу інгредієнта.

Приклади диференціально-діагностичних середовищ:

Середовище Ендо. Складається з МПА з додаванням 1% лактози та знебарвленого натрію сульфітом основного фуксину (індикатор). Середовище Ендо має слаборожевий колір. Використовується в діагностиці кишкових інфекцій для диференціації бактерій, що розкладають лактозу з утворенням кислих продуктів, від бактерій, що не мають цієї здатності. Колонії лактозонозитивних мікробів (кишкова паличка) мають червоний колір унаслідок відновлення фуксину. Колонії лактозонегативних мікроорганізмів - сальмонел, шигел та ін -безбарвні.

До диференціально-діагностичних середовищ відносяться короткий і розгорнутий строкатий ряд. Він складається із середовищ із вуглеводами (середовища Гісса), МСБ, молока, м'ясопептонної желатини.

Середовища Гісса готуються на основі пептонної води, до якої додаються хімічно чисті моно-, ді-або полісахариди (глюкоза, лактоза, крохмаль та ін.).

Для виявлення зрушень рН в результаті утворення кислот і розкладання вуглеводу в додають індикатор. При глибшому розщепленні вуглеводів утворюються газоподібні продукти (СО2, СН4 та інших.), які уловлюються з допомогою поплавців - дрібних пробірочок, опущених у середу догори дном. Середовища з вуглеводами можуть готуватися і щільними – з додаванням 0,5-1% агар-агару. Тоді газоутворення вловлюється за утворенням бульбашок (розривів) у стовпчику середовища.

На МПБ, що входить у строкатий ряд, виявляють продукти, що утворюються при розщепленні амінокислот та пептонів (індол, сірководень). Сірководень виявляється шляхом приміщення МПБ після засіву культури смужки фільтрувального паперу, просоченої розчином оцтовокислого свинцю. При розщепленні амінокислот, що містять сірку, виділяється сірководень, папірець чорніє рахунок утворення сірчистого свинцю. Для визначення індол можна використовувати складний індикатор. Індол утворюється при розщепленні триптофану, і його можна виявити при додаванні до культури, вирощеної МПБ, цього індикатора. За наявності індолу МПБ забарвлюється у зелений чи синій колір.

Сухі середовища.

Поживний агар, і навіть основні диференціально-діагностичні середовища випускаються нині як сухих препаратів, які містять усі необхідні складові. До таких порошків потрібно додати лише воду та зварити, а потім, після розливання, простерилізувати.