До складних поживних середовищ для бактерій належать. Види поживних середовищ. Приклади диференційно-діагностичних середовищ

Мікробіологічне дослідження - це виділення чистих культур мікроорганізмів, культивування та вивчення їх властивостей. Чистими називають культури, які з мікроорганізмів одного виду. Вони потрібні при діагностиці інфекційних хвороб, визначення видової і типової приналежності мікробів, у дослідницькій роботі, отримання продуктів життєдіяльності мікробів (токсинів, антибіотиків, вакцин тощо. п.).

Для культивування мікроорганізмів (вирощування у штучних умовах in vitro) необхідні особливі субстрати – живильні середовища. На середовищах мікроорганізми здійснюють всі життєві процеси (живляться, дихають, розмножуються тощо), тому їх ще називають середовищами для культивування.

Поживні середовища

Поживні середовища є основою мікробіологічної роботи, та його якість нерідко визначає результати всього дослідження. Середовища повинні створювати оптимальні (найкращі) умови для життєдіяльності мікробів.

Вимоги до середовищ

Середовища повинні відповідати таким вимогам:

1) бути поживними, тобто утримувати у легко засвоюваному вигляді всі речовини, необхідні задоволення харчових і енергетичних потреб. Ними є джерела органогенів та мінеральних (неорганічних) речовин, включаючи мікроелементи. Мінеральні речовини не лише входять до структури клітини та активізують ферменти, а й визначають фізико-хімічні властивості середовищ (осмотичний тиск, рН та ін.). При культивуванні низки мікроорганізмів у середовищі вносять чинники зростання - вітаміни, деякі амінокислоти, які клітина неспроможна синтезувати;

Увага! Мікроорганізми, як і всі живі істоти, потребують великої кількості води.

2) мати оптимальну концентрацію водневих іонів - рН, тому що тільки при оптимальній реакції середовища, що впливає на проникність оболонки, мікроорганізми можуть засвоювати поживні речовини.

Для більшості патогенних бактерій оптимальне слаболужне середовище (рН 7,2-7,4). Виняток становлять холерний вібріон - його оптимум знаходиться в лужній зоні (рН 8,5-9,0) та збудник туберкульозу, що потребує слабокислої реакції (рН 6,2-6,8).

Щоб під час зростання мікроорганізмів кислі або лужні продукти їх життєдіяльності не змінили рН, середовища повинні мати буферність, тобто містити речовини, що нейтралізують продукти; обміну;

3) бути ізотонічними для мікробної клітини; тобто осмотичний тиск у середовищі має бути таким самим, як усередині клітини. Для більшості мікроорганізмів оптимальне середовище, що відповідає 0,5% розчину натрію хлориду;

4) бути стерильними, оскільки сторонні мікроби перешкоджають зростанню досліджуваного мікроба, визначенню його властивостей та змінюють властивості середовища (склад, рН та ін.);

5) щільні середовища повинні бути вологими та мати оптимальну для мікроорганізмів консистенцію;

6) мати певний окислювально-відновний потенціал, тобто співвідношення речовин, що віддають і приймають електрони, що виражається індексом RH 2 . Цей потенціал показує насичення середовища киснем. Для одних мікроорганізмів потрібний високий потенціал, для інших – низький. Наприклад, анаероби розмножуються при RH 2 не вище 5, а аероби - при RH 2 не нижче 10. Окисно-відновний потенціал більшості середовищ задовольняє вимогам до нього аеробів та факультативних анаеробів;

7) бути по можливості уніфікованим, тобто утримувати постійні кількості окремих інгредієнтів. Так, середовища для культивування більшості патогенних бактерій повинні містити 0,8-1,2 г/л амінного азоту NH 2 тобто сумарного азоту аміногруп амінокислот і нижчих поліпептидів; 2,5-3,0 г/л загального азоту N; 0,5% хлоридів у перерахунку на хлорид натрію; 1% пептону.

Бажано, щоб середовища були прозорими – зручніше стежити за зростанням культур, легше помітити забруднення середовища сторонніми мікроорганізмами.

Класифікація середовищ

Потреба в поживних речовинах і властивостях середовища в різних видів мікроорганізмів неоднакова. Це унеможливлює створення універсального середовища. Крім того, на вибір того чи іншого середовища впливають цілі дослідження.

В даний час запропоновано величезну кількість середовищ* в основу класифікації яких покладено такі ознаки.

1. Вихідні компоненти. По вихідним компонентам розрізняють натуральні та синтетичні середовища. Натуральні середовища готують із продуктів тваринного та рослинного походження. В даний; час розроблені середовища, у яких цінні харчові продукти (м'ясо та ін.) замінені нехарчовими: кістковим та рибним борошном, кормовими дріжджами, згустками крові та ін. Незважаючи на те що склад поживних середовищ з натуральних продуктів дуже складний і змінюється в залежності від вихідної сировини Ці середовища знайшли широке застосування. Синтетичні середовища готують із певних хімічно чистих органічних та неорганічних сполук, взятих у точно зазначених концентраціях та розчинених у двічі дистильованій воді. Важлива перевага цих середовищ у тому, що їх склад постійний (відомо, скільки і які речовини в них входять), тому ці середовища легко відтворюються.

2. Консистенція(Ступінь щільності). Середовища бувають рідкі, щільні та напіврідкі. Щільні та напіврідкі середовища готують з рідких, до яких для отримання середовища потрібної консистенції додають зазвичай агар-агар або желатин.

Агар-агар - полісахарид, який отримується з певних сортів морських водоростей. Він є для мікроорганізмів поживною речовиною і служить тільки для ущільнення середовища. У воді агар плавиться при 80-100 ° С, застигає при 40-45 ° С.

Желатин – білок тваринного походження. При 25-30 ° С желатинові середовища плавляться, тому культури на них зазвичай вирощують при кімнатній температурі. Щільність цих середовищ при рН нижче 60 і вище 70 зменшується і вони погано застигають. Деякі мікроорганізми використовують желатин як живильне речовина - за її зростання середовище розріджується.

Крім того, як щільне середовище застосовують згорнуту сироватку крові, згорнуті яйця, картопля, середовища з селікагелем.

3. склад. Середовища ділять на прості та складні. До перших відносять м'ясопептонний бульйон (МПБ), м'ясопептонний агар (МПА), бульйон і агар Хоттінгера, поживний желатин та пептонну воду. Складні середовища готують, додаючи до простих середовищ кров, сироватку, вуглеводи та інші речовини, необхідні розмноження тієї чи іншої мікроорганізму.

4. Призначення: а) основні (загальновживані) середовища служать для культивування більшості патогенних бактерій. Це вищезгадані МПА, МПБ, бульйон та агар Хоттінгера, пептонна вода;

б) спеціальні середовища служать виділення і вирощування мікроорганізмів, які ростуть на простих середовищах. Наприклад, для культивування стрептокока до середовищ додають цукор, для пневмо-і менінгококів - сироватку крові, для збудника кашлюку - кров;

в) елективні (виборчі) середовища служать виділення певного виду мікробів, зростання яких вони сприяють, затримуючи чи придушуючи зростання супутніх мікроорганізмів. Так, солі жовчних кислот, пригнічуючи ріст кишкової палички, роблять середовище елективним для збудника черевного тифу. Середовище стає елективним при додаванні до них певних антибіотиків, солей, зміні рН.

Рідкі елективні середовища називають середовищем накопичення. Прикладом такого середовища є пептонна вода з рН 8,0. При такому рН на ній активно розмножується холерний вібріон, інші мікроорганізми не ростуть;

г) диференціально-діагностичні середовища дозволяють відрізнити (диференціювати) один вид мікробів від іншого за ферментативною активністю, наприклад середовища Гісса з вуглеводами та індикатором. При зростанні мікроорганізмів, що розщеплюють вуглеводи, змінюється колір середовища;

д) консервуючі середовища призначені для первинного посіву та транспортування досліджуваного матеріалу; у них запобігає відмирання патогенних мікроорганізмів і пригнічується розвиток сапрофітів. Приклад такого середовища - гліцеринова суміш, що використовується для збирання випорожнень при дослідженнях, що проводяться з метою виявлення низки кишкових бактерій.

Рецепти приготування деяких середовищ наведено наприкінці наступного розділу та у другій частині підручника.

Контрольні питання

1. Яким вимогам мають задовольняти живильні середовища?

2. Як класифікують середовища за вихідними компонентами?

3. Які речовини є для ущільнення середовищ?

4. Які середовища є простими чи загальновживаними і навіщо їх застосовують?

5. Які середовища називають складними, що є їх основою?

6. Які середовища дозволяють отримати переважне зростання одних мікробів при одночасному придушенні інших?

7. У яких середовищах вивчають ферментативну активність мікробів?

Завдання

Заповніть форму, вказавши які групи поділяють середовища.

Приготування середовищ

Посуд для приготування середовищ не повинен містити сторонніх речовин, наприклад, лугів, що виділяються деякими сортами скла, або оксидів заліза, які можуть потрапити в середу при варінні її в іржавих каструлях. Найкраще користуватися скляним, емальованим або алюмінієвим посудом. Великі кількості середовища (десятки та сотні літрів) готують у спеціальних варильних котлах або реакторах (мал. 14). Перед вживанням посуд необхідно ретельно вимити, прополоскати та висушити. Новий скляний посуд попередньо кип'ятять 30 хв в 1-2% розчині хлороводневої кислоти або занурюють у цей розчин на ніч, після чого протягом години прополіскують у проточній воді.

Увага! Посуд, призначений для приготування середовищ, не можна користуватися в інших цілях, наприклад для зберігання хімічних реактивів або розчинів, що дезінфікують - навіть сліди цих речовин можуть завадити зростанню мікроорганізмів.

Вихідною сировиноюдля приготування більшості середовищ служать продукти тваринного або рослинного походження: м'ясо та його замінники, молоко, яйця, картопля, соя, кукурудза, дріжджі та ін.

Основні поживні бульйони готують на м'ясній воді або різних переварах, отриманих при кислотному або ферментативному гідролізі вихідної сировини. Бульйони з переварів у 5-10 разів економічніші, ніж з м'ясної води. Середовища на переварах багатші амінокислотами, отже, поживніші; мають більшу буферність, тобто мають більш стабільну величину рН. Крім того, перевари можна готувати із замінників м'яса (згустків крові, плаценти, казеїну тощо).

В даний час постачання лабораторій м'ясною водою та переварами централізоване. Найчастіше користуються панкреатичним переваром Хоттінгера, гідролізатами казеїну або кормовими дріжджами. З цих напівфабрикатів за певними рецептами готують необхідні середовища.

Етапи приготуваннясередовищ: 1) варіння; 2) встановлення оптимальної величини рН; 3) освітлення; 4) фільтрація; 5) розлив; 6) стерилізація; 7) контроль.

Варятьсередовища на відкритому вогні, водяній бані, в автоклаві або варильних котлах, що підігріваються парою.

Встановлення рНсередовищ орієнтовно виробляють за допомогою індикаторних папірців. Для точного визначення рН користуються потенціометром, застосовуючи скляні електроди відповідно до інструкції або компаратора (апарат Міхаеліса), що складається зі штатива з гніздами для пробірок (рис. 15) та набору стандартів певного рН. При приготуванні середовищ користуються зазвичай індикатором метанітрофенолом, що змінює колір у діапазоні 6,8-8,4.

Для визначення рН середовища пробірки 4, діаметр і колір скла яких не відрізняється від пробірок зі стандартами, поміщають у гнізда 1, 2, 3 і 5 (див. рис. 15). У 1-у та 3-ю пробірки наливають по 5 мл дистильованої води; у 5-у – 7 мл; у 2-у - 4 мл води та 1 мл індикатора. У гнізда 4 та 6 ставлять стандарти потрібного рН. У 1-у, 2-у та 3-ю пробірки наливають 2 мл охолодженого середовища. Вміст пробірок змішують.

Колір рідин в пробірках порівнюють у світлі, що проходить, закривши задній проріз приладу фільтром (матовим або синім, якщо рідини інтенсивно жовті). рН випробуваного розчину відповідає рН стандарту, із кольором якого збігається його колір.

Готуючи середовища із заданим рН, в гнізді 4 і 6 ставлять стандарти, рН яких близький до необхідного, а в 2-у пробірку з випробуваним середовищем і індикатором додають з бюретки певну кількість розчину лугу, якщо рідина у 2-й пробірці світліша за стандарти, або розчину кислоти - якщо світліші стандарти. Луж (або кислоту) доливають до тих пір, поки колір рідини у другій пробірці не співпадає з кольором стандартів. Кількість лугу (або кислоти), додане до 2 мл середовища у 2 пробірці, перераховують на весь обсяг приготовленого середовища. Наприклад, якщо для отримання потрібного рН на 2 мл середовища пішло 2 краплі (0,1 мл) 0,05 н. розчину лугу, то для підлужування 1 л потрібно у 500 разів більше, тобто 50 мл 0,05 н. або 2,5мл 1н. розчину лугу.

При стерилізації рН середовищ знижується на 0,2 тому для отримання середовища з рН 7,2-7,4 її спочатку готують з рН 7,4-7,6.

Освітленнясередовищ виробляють, якщо при варінні вони каламутніють або темніють. Для освітлення в середу, підігріту до 50 ° С, вливають білок курячого яйця, збитий з подвійною кількістю води, перемішують і кип'ятять. Згортаючись, білок захоплює в осад зважені серед частки. У такий же спосіб можна замість яєчного білка використовувати сироватку крові (20-30 мл на 1 л середовища).

Фільтруваннярідких та розплавлених желатинових середовищ виробляють через вологий паперовий або через матер'яні фільтри. Фільтрація агарових середовищ утруднена - вони швидко застигають. Зазвичай їх фільтрують через ватно-марлевий фільтр (у вирву поміщають марлеву серветку і на неї пишну грудку вати). Можна використовувати паперові або матер'яні фільтри, якщо проводити фільтрацію в гарячому автоклаві або у вирвах з підігрівом.

Фільтрацію агарових середовищ можна замінити обстоюванням. Середовище наливають у високу циліндричну посудину і розплавляють в автоклаві. При повільному охолодженні середовища у вимкненому приладі зважені у ній частки осідають на дно. На наступний день агаровий згусток вилучають із судини (для цього посудину ненадовго поміщають у гарячу воду) і відрізають ножем нижню частину з осадом, що накопичилося. Верхню частину розтоплюють та розливають у відповідні ємності.

Розливаютьсередовища в пробірки (по 3-5 мл або по 10 мл), флакони, колби, матраци та пляшки не більше ніж на 2/3 ємності, так як при стерилізації можуть намокнути пробки та середовища втратить стерильність.

Середовище, яке стерилізують при температурі вище 100° С, розливають у чистий сухий посуд. Середовища, що стерилізуються при нижчій температурі, обов'язково розливають у стерильний посуд.

Розливають середовища за допомогою лійки, на кінець якої одягнена гумова трубка із затискачем Мора. Для мірного розливу застосовують мензурки, бюретки, дозатори, шприци-піпетки тощо (мал. 16).

Посуд із середовищем зазвичай закривають ватно-марлевими пробками, поверх яких надягають паперові ковпачки. Важливо, щоб при розливі середовище не змочували краї посуду, інакше до них можуть прилипнути пробки. До кожної посудини обов'язково прикріплюють етикетку з назвою середовища проживання і датою її приготування.

Стерилізація. Режим стерилізації залежить від складу середовища проживання і вказаний у його рецепті. Зразкова схема режиму стерилізації середовищ наведена у табл. 8.

1 (Рідкі середовища з вуглеводами, білками чи вітамінами краще стерилізувати за допомогою бактеріальних фільтрів.)

Контрольготових середовищ: а) контролю стерильності середовища ставлять у термостат на 2 сут, після чого переглядають. Якщо середах не з'являться ознаки зростання, їх вважають стерильними і передають для хімічного контролю за кількома зразків кожної серії; б) хімічний контроль: остаточно встановлюють рН, вміст загального та амінного азоту, пептону, хлоридів (їх кількість має відповідати зазначеному в рецепті).

Хімічний контроль середовищ виробляють у хімічній лабораторії; в) для біологічного контролю кілька зразків середовища засівають спеціально підібраними культурами мікроорганізмів, і за їх зростанням судять про поживні (ростові) властивості середовища. До готового середовища додають етикетку і паспорт, у якому вказують назву та склад середовища, результати контролю та ін.

Зберігають середовища за кімнатної температури в шафах, бажано спеціально для них призначених. Деякі середовища, наприклад, середовища з кров'ю та вітамінами, зберігають у холодильнику.

Рецепти приготування простих (основних) середовищ та ізотонічного розчину натрію хлориду

Ізотонічний розчин натрію хлориду. До 1 л дистильованої води додають 9 г хлориду натрію. Розчин фільтрують, встановлюють заданий рН і, якщо потрібно, стерилізують при 120° протягом 30 хв.

М'ясопептонний бульйон (МПБ). До м'ясної води додають 1% пептону та 0,5% х. ч. натрію хлориду, кип'ятять на слабкому вогні 10-15 хв для розчинення речовин, встановлюють потрібний рН і знову кип'ятять 30-40 хв до випадання осаду. Фільтрують, доливають до первинного об'єму водою і стерилізують 20 хв при 120°.

Бульйон Хоттінтера. Перевар Хоттінгера розводять водою в 5-6 разів залежно від того, яка кількість амінного азоту він містить і яка його кількість має бути в бульйоні (зазначено в паспорті перевару та рецепті середовища). Наприклад, для приготування середовища з 1,2 г/л амінного азоту перевар, що містить 9,0. г/л треба розвести в 7 5 разів (9,0:1,2). До розведеного перевару додають 0,5% натрію хлориду і кип'ятять на слабкому вогні до розчинення солі.

М'ясопептонний агар (МПА). До готового бульйону (до стерилізації або після неї) додають 2-3% подрібненого агар-агару та кип'ятять, помішуючи, на слабкому вогні до повного розплавлення агару. МПА можна варити в автоклаві чи апараті Коха. Готове середовище, якщо потрібно, освітлюють, фільтрують та стерилізують 20 хв при 120°С.

Напіврідкий агар містить 0,4-0,5% агар-агару.

Живильний желатин. До готового бульйону додають 10-15% желатину, підігрівають до його розплавлення (не кип'ятять!), розливають у стерильний посуд і стерилізують плинною парою.

Рецепти приготування складних середовищ

Середовища з вуглеводами. До основного бульйону або розплавленого агару додають потрібну кількість (0,1-2%) певного вуглеводу (наприклад, глюкози). Після його розчинення розливають у стерильний посуд і стерилізують плинною парою. Оскільки вуглеводи частково руйнуються навіть при такому режимі стерилізації, переважно 25-30% розчин вуглеводів, простерилізований через бактеріальний фільтр, додавати в потрібному обсязі з дотриманням асептики до стерильних основних середовищ - після контролю стерильності середовище готове до вживання.

Середовища з кров'юготують зі стерильних простих середовищ, додаючи в асептичних умовах (краще в боксі) від до 30% (зазвичай 5%) стерильної дефібринованої крові. Агарові середовища перед цим розтоплюють і остуджують до 45 ° С. Визначають температуру середовища, підносячи посудину до шиї біля кута нижньої щелепи. При потрібній температурі має бути терпиме відчуття гарячого, але не опіку. Після додавання крові, поки середовище не застигло, вміст судини ретельно перемішують і розливають чашки або пробірки.

Увага! Середовища з кров'ю розтоплювати не можна – кров змінить свої властивості.

Середи із сироваткою кровіготують так само, як середовища з кров'ю. До основних середовищ додають 10-20% сироватки, що не містить консерванту і попередньо інактивованої при 56° протягом 30 хв на водяній бані або в інактиваторі. При інактивації руйнується речовина (комплемент), яка згубно діє на мікроби.

Середи з жовчю. До простих середовищ додають жовч у кількості 10-40% обсягу середовища, встановлюють потрібний рН і стерилізують 20 хв при 120 ° С. Можна додати стерильну жовч до стерильної середовищі в асептичних умовах.

Розлив агарових середовищ у чашки Петрі. Середи перед розливом розплавляють на водяній бані і остуджують до 45-50 ° С. Зазвичай для чашки діаметром 9 см досить 15-20 мл середовища (висота шару 0,25-0,3 см). Якщо шар вище, на ньому менш контрастно виглядають колонії. При дуже тонкому шарі різко обмежена кількість поживних речовин та вологи (середовище швидко висихає) – погіршуються умови культивування.

Розливають середовища у стерильні чашки в асептичних умовах. Чашки ставлять кришкою догори. Посудину з середовищем беруть у праву руку, тримаючи його біля вогню. Лівою рукою виймають пробку, затиснувши її мізинцем та долонею. Обпалюють шийку судини і двома пальцями лівої руки злегка прочиняють кришку. Вводять під неї шийку флакона, не торкаючись їм краю чашки. Наливаючи середовище, стежать, щоб воно рівномірно розподілилося по дну чашки. Якщо при розливі на поверхні середовища утворюються бульбашки повітря, до них до того, як середовище застигне, підносять полум'я сірника або пальника – бульбашки луснуть. Потім чашку закривають і дають застигнути середовищі. Якщо сівбу проводять у день розливу, середу необхідно підсушити. Для цього чашки в термостаті обережно відкривають та встановлюють кришки та чашки відкритою стороною вниз на 20-30 хв. Якщо посів проводять наступного дня після розливу, чашки, не підсушуючи, загортають у той самий папір, у якому їх стерилізували, і поміщають у холодильник.

Приготування скошеного агару. Пробірки з 4-5 мл стерильного розплавленого агарового середовища укладають у похилому положенні (приблизно під кутом 20°) з таким розрахунком, щоб середовище не заходило за 2/3 пробірки, інакше воно може змочити пробку. Після того, як середовище застигне, пробірки ставлять вертикально - дають стекти конденсату. Краще вживати свіжоскошений агар.

Увага! Користуватися середовищем, у якому немає конденсату, не можна. Її слід знову розтопити на водяній бані та скосити.

Сухі середовища

Вітчизняна промисловість випускає сухі середовища різного призначення: прості, елективні, диференційно-діагностичні, спеціальні. Це порошки у флаконах з кришками, що загвинчуються. Зберігають сухі середовища у темному місці щільно закритими – вони гігроскопічні. У лабораторії з порошків готують середовища пропису на етикетці.

Перевага сухих середовищ у порівнянні з середовищами, виготовленими в лабораторії - стандартність (їх випускають великими партіями), простота приготування, що робить їх доступними в будь-яких (навіть похідних) умовах, стабільність, економічність. Важливо, що їх можна готувати із замінників м'яса: гідролізату казеїну, фібрину, кільки та навіть білкових фракцій мікробних клітин (сарцин).

Контрольні питання

1. Яким має бути рН середовищ для культивування більшості патогенних мікробів перед стерилізацією та чому?

2. За якої температури плавляться і застигають агарові середовища?

3. Як повинен бути підготовлений посуд, в який розливають середовища з вуглеводами та білками?

Завдання

1. Приготуйте МПБ, МПА, бульйон та агар Хоттінгера з рН 7,2-7,4, розлийте у флакони та пробірки; простерилізуйте.

2. Приготуйте із сухих порошків середовища Гісса, розлийте в пробірки по 4-5 мл і простерилізуйте.

3. Приготуйте агар із кров'ю та розлийте його в чашки Петрі.

4. Приготуйте із сухих порошків середовища Ендо, ЕМС, Плоскірєва і розлийте їх у чашки Петрі.

5. Приготуйте скошений агар.

Методи посівів

Важливим етапом бактеріологічного дослідження є посів. Залежно від мети дослідження, характеру посівного матеріалу та середовища використовують різні методи посіву. Всі вони включають обов'язкову мету: захистити посів від сторонніх мікробів. Тому працювати слід швидко, але без різких рухів, що посилюють коливання повітря. Під час посівів не можна розмовляти. Посіви краще робити у боксі.

Увага! Не забувайте виконувати правила особистої безпеки під час роботи з матеріалом.

Посів із пробірки в пробірку. Пробірку з посівним матеріалом та пробірку з середовищем тримають злегка похило в лівій руці між великим і вказівним пальцями так, щоб краї пробірок були на одному рівні, а їх підстави знаходилися поверх кисті. Зазвичай пробірку із посівним матеріалом тримають ближче до себе. У правій руці, як письмове перо, тримають бактеріальну петлю, і стерилізують її, тримаючи вертикально в полум'ї пальника. Мізинцем та краєм долоні правої руки виймають обидві пробки одночасно. Виймають пробки не ривком, а плавно – легкими гвинтовими рухами. Вийнявши пробки, краї пробірок обпалюють полум'я пальника. Прожарену петлю вводять через полум'я пальника в пробірку з посівним матеріалом, охолоджують і, набравши трохи матеріалу, обережно переносять у пробірку із середовищем.

При посіві рідке середовище посівний матеріал розтирають на стінці пробірки над рідиною і змивають середовищем.

При посіві на рідкі середовища тампоном його занурюють у середу та 3-5 с ополіскують у ній. При сівбі на щільне середовище матеріал втирають у її поверхню, обертаючи тампон, після чого тампон знезаражують (поміщають у пробірку, в якій він був доставлений до лабораторії, та автоклавують).

Увага! Слідкуйте, щоб середовище не вилилося і не змочило пробку.

При сівбі на скошений агар матеріал зазвичай розтирають на поверхні середовища зигзагоподібними рухами знизу вгору, починаючи від межі конденсату.

При сівбі на щільні середовища, розлиті в пробірки стовпчиком, петлею з посівним матеріалом проколюють стовпчик, виробляючи так званий посів "уколом".

Після посіву петлю вилучають із пробірки, краї пробірок обпалюють і, провівши пробки через полум'я пальника, закривають пробірки, після чого прожарюють петлю.

Посів рідкого матеріалу можна проводити стерильними піпетками (пастерівськими або градуйованими). Після посіву піпетки занурюють у дезінфікуючу рідину.

Посіви у флакони, матраци і бутлі виробляють приблизно так, як у пробірки, тільки спочатку набирають матеріал (петлею або піпетку), а потім відкривають посудину з середовищем.

Судини із засіяною культурою написують і ставлять у термостат.

Посів на пробірки з чашки Петрі. Вивчивши характер зростання культури на чашці, з боку дна відзначають восковим олівцем необхідну посіву ділянку. Чашку з посівним матеріалом ставлять перед собою кришкою догори. Лівою рукою відкривають кришку і вводять під неї обпалену петлю. Охолодивши петлю, набирають посівний, матеріал із зазначеної ділянки. Виймають петлю, закривають чашку й у ліву руку беруть пробірку із середовищем. Посів проводять так само, як із пробірки в пробірку. Після посіву чашку повертають догори дном.

Посів на агар у чашки Петрі. Посів шпателем. Шпатель – це скляна або металева трубочка, кінець якої загнутий у вигляді трикутника. Шпатель можна зробити з пастерівської піпетки, зігнувши під кутом її тонкий кінець, попередньо розігрітий в полум'ї пальника.

Лівою рукою злегка відкривають кришку, тримаючи її великим і вказівним пальцем. Петлею, піпеткою або скляною паличкою наносять на поверхню середовища посівний матеріал, після чого ретельно втирають його круговими рухами шпателя доти, доки шпатель не перестане вільно ковзати по поверхні середовища, лівою рукою при цьому притримують кришку і одночасно обертають чашку. По закінченні посіву шпатель виймають із чашки та закривають кришку. Скляний шпатель поміщають у дезінфікуючий розчин, а металевий прожарюють у полум'ї пальника.

Посів петлею. Невелика кількість посівного матеріалу (іноді його попередньо емульгують у стерильному ізотонічному розчині або бульйоні) втирають петлею в поверхню середовища біля краю чашки, кілька разів проводячи петлею з боку на бік. Потім біля того місця, де закінчилися штрихи, агар проколюють петлею, знімаючи надлишок посівного матеріалу. Посівний матеріал, що залишився на петлі, зигзагоподібними рухами розподіляють по всій поверхні середовища. Після закінчення посіву закривають чашку і пропалюють петлю.

Посів петлею на сектори. Чашку з боку дна розкреслюють на сектори. Посів виробляють зигзагоподібними рухами від краю чашки до центру. Потрібно стежити, щоб штрихи не заходили на сусідній сектор.

Посів тампоном. Тампон з посівним матеріалом вносять у трохи відкриту чашку і круговими рухами втирають його вміст у поверхню середовища, обертаючи при цьому тампон і чашку.

Посів газоном. Приблизно 1 мл (20 крапель) рідкої культури (якщо культура із щільного середовища, її емульгують у стерильному ізотонічному розчині або бульйоні) наносять на поверхню агару і ретельно розподіляють рідину по поверхні середовища. Чашку злегка нахиляють і піпеткою відсмоктують надлишок культури, виливаючи в дезинфікуючий розчин. Туди ж поміщають піпетку.

Посів у товщу агару. Культуру, вирощену на рідкому середовищі, або емульгований матеріал вносять у посудину з розплавленим і остудженим до 45° З агаром, перемішують і виливають у стерильну чашку Петрі. Можна внести посівний матеріал у порожню чашку і залити 15-20 мл остудженого до 45 ° С агару. Для перемішування вмісту чашки її трохи похитують і обертають. Чашки залишають на столі до застигання середовища.

Засіяні чашки підписують із боку дна і поміщають у термостат дном нагору.

Контрольні питання

1. Чи потрібні асептичні умови під час сівби? Обґрунтуйте відповідь.

2. Як потрібно обробити робоче місце після посівів?

Методи культивування

Для успішного культивування, крім правильно підібраних середовищ та правильно виробленого посіву, необхідні оптимальні умови: температура, вологість, аерація (постачання повітрям). Як правило, відповідні умови вдається створити, ретельно відтворивши умови природної обстановки.

Температура. Оптимальну температуру для культивування більшості патогенних мікроорганізмів (37 ° С) виробляють у термостаті (рис. 17). Це прилад із подвійними стінками, між якими знаходиться повітря або вода, що підігріваються електрикою. Він забезпечений терморегулятором, що автоматично підтримує потрібну температуру, і термометром для контролю за температурою.

Пробірки з посівами в штативах, дротяних сітках або банках встановлюють на полицях термостата. Чашки в термостаті повинні стояти догори дном. Щоб повітря в термостаті вільно циркулювало і нагрівання було рівномірним, полиці в термостаті роблять з прорізами і щільно не завантажують. Щоб не охолодити культуру, термостат не залишають надовго відкритим.

Лаборант зобов'язаний щодня реєструвати температуру в термостаті та підтримувати чистоту в приладі, а при несправності викликати майстра.

Світлопереважній більшості мікробів (до них відносяться всі патогенні) не потрібен – їх культивують у темряві. Однак для вивчення пігментоутворення, яке відбувається активніше на розсіяному світлі, культури після термостату витримують 2-3 дні при кімнатному освітленні.

Увага! Слід уникати попадання прямих сонячних променів, що діють на культури згубно.

Вологість. Життя мікробів неможливе без вологи - поживні речовини проникають у клітину лише у розчиненому вигляді. Це необхідно враховувати при культивуванні на щільних середовищах: розливати їх у чашки та скошувати в пробірках краще за день посіву. При культивуванні мікробів, особливо чутливих до відсутності вологи, наприклад гонококів, термостат ставлять відкритий посудину з водою.

Терміни культивування. Більшість патогенних мікробів культивують 18-24 год, але є види, що ростуть повільно (до 4-6 тижнів). Щоб зберегти в них вологу, ватяні пробки після посіву замінюють стерильними гумовими або надягають на них гумові ковпачки.

Увага! Гумові пробки стерилізують в автоклаві, загорнутими в папір.

Аерація. За потреби мікробів у вільному кисні їх ділять на аероби та анаероби. Обидві групи потребують різних умов культивування.

Надходження кисню, необхідного для культивування аеробів та факультативних анаеробів, здійснюється при пасивній та активній аерації.

Пасивна аерація - це культивування на щільних і рідких середовищах у судинах, закритих ватяними або ватно-марлевими пробками, або чашки Петрі. При такому культивуванні мікроби споживають кисень, розчинений у середовищі, що знаходиться в посудині над середовищем і надходить через корок. Пасивно аеровані культури можна вирощувати на поверхні або тонкому шарі середовища, куди проникає кисень повітря.

Активну аерацію застосовують при глибинному культивуванні мікробів, коли їх вирощують у великих обсягах середовища. Щоб достатньо забезпечити киснем такі культури, їх поміщають у спеціальні гойдалки - постійне перемішування культури забезпечує зіткнення з повітрям. При культивуванні в обсягах рідини, що досягають десятків і сотень літрів, що проводиться в приладах, які називають реакторами або ферментерами, повітря продувають через культуру за допомогою спеціальних пристроїв.

Культивування анаеробівскладніше, ніж аеробів, оскільки необхідно позбавити доступу вільного кисню повітря. Для цього видаляють повітря з живильного середовища різними способами.

Культивування актиноміцетів, грибів, мікоплазм, L-форм, спірохет та найпростіших. Культивування цих мікроорганізмів важливо схоже з культивуванням мікробів. Для них розроблені спеціальні середовища та підібрані режими, що відповідають їх потребам.

Чистою культурою називають скупчення мікробів одного виду на щільному або рідкому поживному середовищі.

Існує ряд методів виділення чистої культури залежно від властивостей матеріалу, що вивчається, і мети дослідження. Зазвичай чисті культури отримують із ізольованих колоній - відокремлених скупчень мікробів на щільному середовищі. Вважають, що найчастіше колонія розвивається із однієї мікробної клітини, тобто є чистою культурою цього мікроорганізму.

Етапи виділення чистої культури:

1-й день – отримання ізольованих колоній. Краплю досліджуваного матеріалу петлею, піпеткою або скляною паличкою наносять на поверхню агару в чашці Петрі. Шпателем втирають матеріал у поверхню середовища; не пропалюючи і не перевертаючи шпателя, роблять посів на 2-й, а потім на 3-й чашці. При такому посіві на 1-ю чашку припадає багато матеріалу і багато мікробів, на 2-ю менше і на 3-ю ще менше.

Можна отримати ізольовані колонії при сівбі петлею. Для цього досліджуваний матеріал емульгують у бульйоні або ізотонічному розчині хлориду натрію.

2-й день – вивчають зростання мікробів на чашках. У 1-й чашці зазвичай буває суцільне зростання - виділити ізольовану колонію не вдається. На поверхні агару у 2-й та 3-й чашці виростають ізольовані колонії. Їх вивчають неозброєним оком, за допомогою лупи, при малому збільшенні мікроскопа та іноді у стереоскопічному мікроскопі (див. розділ 31). Потрібну колонію відзначають із боку дна чашки та пересівають на скошений агар. Посіви ставлять у термостат.

Увага! Пересівати можна лише ізольовані колонії.

3-й день – вивчають характер зростання на скошеному агарі. Роблять мазок, фарбують його і, переконавшись, що культура чиста, приступають до її вивчення. У цьому виділення чистої культури закінчується. Виділена з певного джерела та вивчена культура, називається штамом.

При виділенні чистої культури з крові (гемокультури) її попередньо "підрощують" у рідкому середовищі: 10-15 мл стерильно взятої крові засівають у 100-150 мл рідкого середовища. Так роблять тому, що у крові зазвичай мало мікробів. Співвідношення крові, що засівається, і живильного середовища 1:10 не випадково - так досягається розведення крові (нерозведена кров згубно діє на мікроорганізми). Колби із посівом ставлять у термостат. Через добу (іноді через більший час залежно від культури, що виділяється) з вмісту колб роблять висіви на чашки для отримання ізольованих колоній. При необхідності повторюють висів з інтервалами 2-3 дні.

При виділенні чистої культури із сечі, промивних вод шлунка та інших рідин їх попередньо центрифугують в асептичних умовах та засівають осад. Подальше виділення чистої культури виробляють звичайним способом.

Для виділення чистої культури широко застосовують елективні середовища.

У ряді методів для отримання чистих культур використовують біологічні особливості мікроба, що виділяється. Наприклад, при виділенні спороутворюючих бактерій посіви прогрівають при 80° 10 хв, вбиваючи цим вегетативні форми; при виділенні збудника туберкульозу, стійкого до кислот та лугів, за допомогою цих речовин посівний матеріал звільняють від супутньої флори; для виділення пневмокока і палички чуми досліджуваний матеріал вводять білим мишам - у тому організмі, високочутливому до даних збудникам, ці мікроби розмножуються швидше за інших.

У науково-дослідній роботі, особливо під час генетичних досліджень, необхідно отримувати культури свідомо з однієї клітини. Така культура називається клоном. Для її отримання найчастіше користуються мікроманіпулятором - приладом, з інструментами (голками, піпетками) мікроскопічних розмірів. За допомогою тримача під контролем мікроскопа їх вводять у препарат "висяча крапля", витягують потрібну клітину (одну) і переносять її в живильне середовище.

Вивчення виділених культур

Вивчення морфології, рухливості, тинкторіальних властивостей (див. розділ 3), характеру зростання на середовищах (культуральні властивості), ферментативної активності та низки інших особливостей виділеного мікроба дозволяє встановити його таксономічне становище, тобто класифікувати мікроорганізм: визначити його рід, вид, тип, підтип, різновид. Це називається ідентифікацією. Ідентифікація мікроорганізмів дуже важлива при діагностиці інфекцій, встановленні джерел та шляхів її передачі та у низці інших науково-практичних досліджень.

Культуральні властивості

Різні види мікроорганізмів по-різному зростають на середовищах. Ці відмінності служать їх диференціації. Одні добре ростуть на простих середовищах, інші – вимогливі та ростуть тільки на спеціальних. Мікроорганізми можуть давати рясне (пишне) зростання, помірне або мізерне. Культури можуть бути безбарвними, сіруватими, сіро-блакитними. Культури мікроорганізмів, що утворюють пігмент, мають різноманітне забарвлення: біле, жовте або золотисте у стафілококу, червоне - у чудової палички, синьо-зелену - у синьо-зеленої палички, пігмент якої, розчинний у воді, забарвлює не тільки колонії, але й середовище.

На щільнихСеред мікроорганізмів в залежності від кількості посівного матеріалу утворюють або суцільний наліт ("газон"), або ізольовані колонії. Культури бувають грубі та ніжні, прозорі та непрозорі, з поверхнею матової, блискучою, гладкою, шорсткою, сухою, бугристою.

Колонії можуть бути великі (4-5 мм у діаметрі і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1-2 мм) та карликові (менше 1 мм). Вони розрізняються за формою, розташуванням на поверхні середовища (опуклі, плоскі, куполоподібні, вдавлені, круглі, розеткоподібні), формою країв (рівні, хвилясті, порізані).

У рідкихСеред мікроорганізми можуть утворювати рівномірну каламут, давати осад (зернистий, пилоподібний, пластівеподібний) або плівку (ніжну, грубу, зморшкувату).

На напіврідкихсередовищах при посіві уколом рухливі мікроби викликають помутніння товщі середовища, нерухомі - ростуть тільки по "уколу", залишаючи решту прозорої.

Культуральні властивості визначають, вивчаючи характер зростання культури простим оком, за допомогою лупи під малим збільшенням мікроскопа або користуючись стереоскопічним мікроскопом. Величину і форму колоній, форму країв і прозорість вивчають у світлі, що проходить, розглядаючи чашки з боку дна. У відбитому світлі (з боку кришки) визначають характер поверхні, фарбування. Консистенцію визначають дотиком петлі.

Морфологічні властивості

Вивчення морфології мікробів теж служить їх диференціації. Морфологію вивчають у забарвлених препаратах. Встановлюють форму та величину клітин, їх розташування у препараті, наявність спор, капсул, джгутиків. У пофарбованих препаратах визначають відношення мікробів до фарб (тинкторіальні властивості) - добре або погано сприймають фарби, як відноситься до диференціальних забарвлень (у якій колір забарвлюється за Грамом, Цилем - Нільсеном та ін.). Вітальне (прижиттєве) забарвлення дозволяє встановити рухливість, віддиференціювати живі та мертві клітини, стежити за їх поділом. Поділ та рухливість можна вивчати в нативних (незабарвлених) препаратах (див. розділ 3).

Ферментативна активність

Ферментативна активність мікроорганізмів багата та різноманітна. Нею можна встановити як видову і типову приналежність мікроба, а й визначити його варіанти (так звані біовари). Розглянемо основні ферментативні властивості та його якісне визначення.

Розщеплення вуглеводів(сахаролітична активність), тобто здатність розщеплювати цукру та багатоатомні спирти з утворенням кислоти або кислоти та газу, вивчають на середовищах Гісса, які містять той чи інший вуглевод та індикатор. Під дією кислоти, що утворюється при розщепленні вуглеводу, індикатор змінює забарвлення середовища. Тому ці середовища названі "строкатий ряд". Мікроби, що не ферментують цей вуглевод, ростуть на середовищі, не змінюючи її. Наявність газу встановлюють за утворенням бульбашок у середовищах з агаром або за скупченням його в "поплавці" на рідких середовищах. "Поплавок" - вузька скляна трубочка із запаяним кінцем, зверненим нагору, яку до стерилізації поміщають у пробірку із середовищем (рис. 18).

Рис. 18. Вивчення цукролітичної активності мікроорганізмів. I - "строкатий ряд": а - рідке середовище з вуглеводами та індикатором Андреде; б – напіврідке середовище з індикатором ВР: 1 – мікроорганізми не ферментують вуглевод; 2 - мікроорганізми ферментують вуглевод із утворенням кислоти; 3 - мікроорганізми ферментують вуглевод з утворенням кислоти та газу; II - колонії мікроорганізмів, що не розкладають (безбарвні) і розкладають лактозу (фіолетові на середовищі ЕМС - зліва, червоні на середовищі Ендо - праворуч)

Крім того, сахаролітичну активність вивчають на середовищах Ендо, ЕМС, Плоскірєва. Мікроорганізми, зброджуючи до кислоти в цих середовищах молочний цукор (лактозу), утворюють забарвлені колонії - кислота змінює колір індикатора. Колонії мікробів, що не ферментують лактозу, безбарвні (див. рис. 18).

Молоко при зростанні мікробів, що зброджує лактозу, згортається.

При зростанні мікроорганізмів, що утворюють амілазу, на середовищах із розчинним крохмалем відбувається його розщеплення. Про це дізнаються, додавши до культури кілька крапель розчину Люголя – колір середовища не змінюється. Нерозщеплений крохмаль дає із цим розчином синє фарбування.

Протеолітичні властивості(Тобто здатність розщеплювати білки, поліпептиди і т. п.) вивчають на середовищах з желатином, молоком, сироваткою, пептоном. При зростанні на желатиновому середовищі мікробів, що ферментують желатин, середовище розріджується. Характер розрідження, що викликається різними бактеріями, різний (рис. 19). Мікроби, що розщеплюють казеїн (молочний білок), викликають пептонізацію молока - воно набуває вигляду молочної сироватки. При розщепленні пептонів можуть виділятися індол, сірководень, аміак. Їхню освіту встановлюють за допомогою індикаторних папірців. Фільтрувальний папір заздалегідь просочують певними розчинами, висушують, нарізають вузькими смужками довжиною 5-6 див і після посіву культури на МПБ поміщають під пробку між нею та стінкою пробірки. Після інкубації у термостаті враховують результат. Аміак викликає посиніння лакмусового папірця; при виділенні сірководню на папірці, просоченому 20% розчином свинцю ацетату та натрію гідрокарбонату, відбувається утворення свинцю сульфату - папірець чорніє; індол викликає почервоніння папірця, просоченого розчином щавлевої кислоти (див. рис. 19).

Крім зазначених середовищ, здатність мікроорганізмів розщеплювати різні поживні субстрати визначають за допомогою паперових дисків, просочених певними реактивами (індикаторні системи паперові "СІБ"). Ці диски опускають у пробірки з досліджуваної культурою і вже через 3 години інкубації в термостаті при 37° З зміни кольору дисків судять про розкладання вуглеводів, амінокислот, білків і т.д.

Гемолітичні властивості (здатність руйнувати еритроцити) вивчають на середовищах із кров'ю. Рідкі середовища у своїй стають прозорими, але в щільних середовищах навколо колонії з'являється прозора зона (рис. 20). При утворенні метгемоглобіну середовище зеленіє.

Збереження культур

Виділені та вивчені культури (штами), що становлять цінність для науки або виробництва, зберігають у музеях живих культур. Загальносоюзний музей знаходиться у Державному НДІ стандартизації та контролю медичних біологічних препаратів ім. Л. А. Тарасевича (ДІБК).

Завдання зберігання - підтримати життєздатність мікроорганізмів та попередити їх мінливість. Для цього треба послабити або припинити обмін у мікробній клітині.

Один з найдосконаліших методів тривалого збереження культур – ліофілізація – висушування у вакуумі із замороженого стану дозволяє створити стан анабіозу. Висушування проводять у спеціальних апаратах. Зберігають культури в запаяних ампулах при температурі 4 ° С, краще -30-70 ° С.

Відновлення висушених культур. Сильно нагрівають кінчик ампули в полум'ї пальника і торкаються нього ватним тампоном, злегка змоченим холодною водою, щоб на склі утворилися мікротріщини, через які повітря повільно проникне всередину ампули. При цьому, проходячи через розігріті краї тріщин, повітря стерилізується.

* (При надлишку води на тампоні вона може потрапити в ампулу і порушити стерильність культури: її засмокче через мікротріщини, що утворилися, так як в ампулі вакуум.)

Увага! Не забувайте, що у запаяній ампулі вакуум. Якщо повітря в неї потрапляє відразу через великий отвір, може розпорошитися культура, що знаходиться в ампулі, і відбутися її викид.

Давши увійти в повітря, швидко пінцетом надламують і видаляють верхівку ампули. Злегка обпалюють отвір і пастерівською стерильною піпеткою або шприцом вносять в ампулу розчинник (бульйон або ізотонічний розчин). Перемішують вміст ампули і засівають на середовищі. Зростання відновлених культур у перших посівах може бути сповільнене.

Довго зберігати культури можна також у рідкому азоті (-196 ° С) у спеціальних приладах.

Методи нетривалого збереження культур такі: 1) субкультивування (періодичні пересіви на свіжі середовища) з інтервалами, що залежать від властивостей мікроорганізму, середовища та умов культивування. Між пересіваннями культури зберігають при 4°; 2) збереження під шаром олії. Культуру вирощують в агарі стовпчиком висотою 5-6 см, заливають стерильною вазеліновою олією (шар олії приблизно 2 см) і зберігають вертикально в холодильнику. Терміни зберігання різних мікроорганізмів різні, тому з пробірок періодично висівають культуру, щоб перевірити її життєздатність; 3) зберігання при -20-70 ° С; 4) зберігання у запаяних пробірках. При необхідності зберігається матеріал висівають на свіже середовище.

Контрольні питання

1. Що входить у поняття "бактеріологічне дослідження"?

2. Якою має бути культура для такого дослідження?

3. Що таке колонія бактерій, культура, штам, клон?

4. Що входить у поняття "культуральні властивості мікробів"?

Завдання

1. Вивчіть та опишіть кілька колоній. Пересійте їх на скошений агар та на сектор.

2. Вивчіть та опишіть характер зростання – культури на скошеному агарі. Визначте чистоту та морфологію культури у забарвленому препараті.

3. Пересійте культуру зі скошеного агару на бульйон та на диференціально-діагностичні середовища. Вивчіть та запишіть у протокол характер зростання культури на цих середовищах та її ферментативні властивості.

М'ясопептонний бульйон та м'ясопептонний агар є придатними для більшості бактерій найпростішими поживними середовищами. Вихідним матеріалом для приготування цих та інших поживних середовищ служить м'ясна вода, що являє собою жовту прозору рідину з кислою реакцією. М'ясна вода містить розчинні білкові речовини (альбуміни), екстрактивні речовини та деякі солі.

М'ясна вода та концентрований м'ясопептонний бульйон (за ГОСТом 10444-63)

М'ясо яловиче або кінське після видалення кісток, жиру та сухожилля пропускають через м'ясорубку, і фарш заливають холодною водопровідною водою, вливаючи на кожні 500 г м'ясного фаршу 1 л води. Після перемішування суміш повільно нагрівають до кипіння та помірне кипіння підтримують протягом 1,5 год. Невелика кількість суміші фаршу з водою (до 5 л) можна кип'ятити на відкритому вогні, часто помішуючи, щоб не сталося пригоряння дрібних частинок м'яса.

Велику кількість краще кип'ятити у казанах з паровою сорочкою. Готовність м'ясної води визначають фільтруванням невеликої кількості їх у пробірку через паперовий фільтр. Якщо фільтрат прозорий, м'ясна вода готова. Якщо ж фільтрат виходить каламутним, то варіння слід робити доти, доки не вийде прозорий фільтрат. Після закінчення варіння рідину відціджують через полотно або вдвічі складену марлю, віджимають із вареного м'яса весь сік та отриману рідину доводять кип'яченою водою до початкового об'єму. Додавання великої кількості води зазвичай не потрібно, тому що в результаті варіння у м'ясну воду переходить багато соку з м'яса. Тільки при занадто тривалому варінні та дуже бурхливому кипінні спостерігається велике випарювання рідини.

Отриману м'ясну воду розливають у скляні півлітрові банки, закочують і стерилізують в автоклаві 20 хв за нормальної температури 120 °З. Із заготовленої таким чином м'ясної води при необхідності готують необхідні живильні середовища.

Щоб отримати концентрований м'ясопептонний бульйон (МПБ), до 1 л м'ясної води додають 10 г пептона1 та 5 г хлористого натрію. Доводять реакцію середовища до pH 7,0-7,2, кип'ятять, фільтрують через паперовий фільтр, розливають у чисті пробірки та, закривши ватними пробками, стерилізують в автоклаві 20 хв при температурі 120 °С.

Розведений м'ясопептонний бульйон

Приготування м'ясної води проводиться так само, як для концентрованого бульйону, але замість 500 г м'ясного фаршу береться 250 г його на 1 л води. Можна заготовлену концентровану м'ясну воду розвести вдвічі. До 1 л розведеної м'ясної води додають 5 г пептону, 2,5 г хлористого натрію, встановлюють pH 7,0-7,2, а далі роблять так само, як при приготуванні концентрованого м'ясопептонного бульйону.

Рибопептонний бульйон

На заводах, що виробляють рибні консерви, замість м'ясної води для приготування середовищ можна користуватися рибною водою. Рибну воду слід готувати з великої худої риби. Найкраще для цієї мети підходить судак, тріска чи щука. Звільнену від кісток та жиру рибу пропускають через м'ясорубку та заливають холодною водопровідною водою з розрахунку 1 л води на 500 г рибного фаршу. Всі подальші операції приготування рибної води аналогічні до операцій приготування м'ясної води.

Рибна вода використовується для приготування рибопептонного бульйону. На 1 л рибної води додають 10 г пептону, 5 г кухонної солі, нейтралізують до pH 7,0-7,2 і стерилізують так само, як м'ясопептонний бульйон.

Розлив бульйону в пробірки (перед стерилізацією) проводиться через скляну вирву, на кінець якої надіта гумова трубка з наконечником та затискачем Мора (рис. 52). Скляний наконечник слід кілька занурювати при розливі в пробірку, щоб краї пробірки не змочувалися бульйоном, інакше ватна пробка присохне до скла і може прорости мікроорганізмами.

Встановлення реакції живильних середовищ

При мікробіологічних дослідженнях завжди доводиться враховувати кислотні та лужні властивості поживних середовищ. Активна кислотність поживного субстрату має, як зазначалося, велике значення у життєвих процесах мікробів: вона впливає їх зростання, морфологічні і фізіологічні властивості. Для більшості бактерій необхідне середовище з pH 7,2-7,4, для дріжджів та плісняв - з pH 4,5-5,5.

Поживні середовища, що готуються виявлення біохімічних властивостей мікробів, повинні мати оптимальну, суворо визначену для даного мікроба реакцію. Встановити pH приготовленого середовища в мікробіологічній лабораторії можна або електрометричним або колориметричним методами. Електрометрично pH визначають за допомогою лабораторного рН-метра (наприклад, ЛП-58 – рис. 53) або іономіру (КФВ-І1 – рис. 54).

Щоб виміряти величину pH досліджуваного живильного середовища за допомогою іономеру, склянку наливають близько 40 мл цього середовища, занурюють в неї патрон з хлор-срібним напівелементом і приєднують електродний пристрій. Стрілки гальванометра відхиляються та показують значення величини pH.

При використанні лабораторного рН-метра (ЛП-58) зручніше застосовувати скляний та каломельний електроди. Кулька скляного електрода має дуже тонкі стінки - 0,03-0,05 мм, тому при роботі з ним потрібно бути обережними. Перед застосуванням скляний електрод слід не менше 1-2 годин витримувати в дистильованій воді, а при частій експлуатації потрібно постійно зберігати його в дистильованій воді, періодично замінюючи її свіжою.

Перед вимірюванням pH скляним електродом проводять коригування шкали pH буферного розчину. Розмір pH буферного розчину має бути близька до pH досліджуваного розчину. Температурний компенсатор приладу встановлюють на температуру буферного розчину та налаштовують підсилювач та потенціометричну частину приладу за нормальним елементом. Потім, промив дистильованою водою електроди і вимірювальний посудину, наповнюють його досліджуваним середовищем і вимірюють pH середовища; встановлюючи температурний компенсатор на температуру середовища і натискаючи кнопку для включення приладу на передній дошці рН-метра, помічають показання стрілки гальванометра на шкалі pH. Детально правила користування, налаштування та догляду за приладами описуються в інструкціях, що додаються до приладів. Тривалість аналізу 3-5 хв. Результати досить точні.

Електрометрично за допомогою рН-метра та іономіру дуже зручно перевіряти pH готових середовищ. Оскільки при виготовленні поживних субстратів для бактеріологічних аналізів доводиться як фіксувати існуючий рівень pH середовища, а й доводити реакцію до певного його значення, то практиці виявився зручнішим колориметричний метод.

В основу колориметричного методу покладено властивість індикаторів змінювати своє забарвлення зі зміною концентрації іонів H-розчинів. Для кожного індикатора характерний свій діапазон pH, в межах якого його колір змінюється. Згідно з ГОСТом 10444-63 для встановлення pH поживних середовищ застосовують 0,04% розчин бромтимолового синього. Діапазон бромтимолового синього 6,0-7,6. У кислих середовищах він набуває жовтого забарвлення, у лужних - синє. При pH 7,1 дає салатово-зелене забарвлення.

Для визначення реакції середовища або консервів після розвитку в них мікроорганізмів застосовують 0,04% розчин бромкрезолпурпуру. Бромкрезолпурпур змінює забарвлення у діапазоні pH 5,2-6,3. У кислих середовищах він блідо-жовтий, у нейтральних – червоно-фіолетовий, а при pH 6,3 дає зелене з пурпурним відтінком забарвлення.

Індикатори готують наступним чином: 0,1 г відповідного індикатора, зваженого на аналітичних терезах, розтирають у ступці (бажано агатової) з 1/20 н. розчином їдкого натру. Для розчинення 0,1 г бромтимолового блакитного беруть 3,2 мл 1/20 н. розчину NaOH; для розчинення 0,1 г бромкрезолпурпуру – 3,7 мл 1/20 н. розчину лугу. До отриманого лужного розчину додають 250 мл дистильованої води і отримують 0,04% розчин індикатора. Приготовлений розчин індикатора слід зберігати на холоді у скляних судинах із притертою пробкою.

Перед стерилізацією pH середовища доводять до рівня (7,0-7,2). Для цього у велику колбу (2-3 л) вливають 1,5 л поживного середовища. З бюретки в неї починають приливати по краплях 10% розчин двовуглекислої соди або слабкий розчин лугу (наприклад, 0,1 н. розчин їдкого натру), весь час перевіряючи реакцію середовища по індикатору (в даному випадку по бромтимоловому синьому). Для цього на білу порцелянову плитку (можна навіть кахельну) наносять кілька крапель середовища, до яких додають краплю індикатора. Якщо бромтимоловий синій при цьому дасть жовте забарвлення, то приливання соди або лугу потрібно продовжувати доти, доки середа від краплі індикатора не забарвиться салатово-зелений колір. Якщо в краплі досліджуваного середовища при внесенні індикатора з'являється зелено-синій тон, то лужний розчин при титруванні прилитий у надлишку і в колбу з середовищем слід додати свіже, ще не титроване живильне середовище і знову перевірити реакцію.

Прекрасно зарекомендував себе на практиці за допомогою компаратора та стандартної шкали Міхаеліса. Цей метод є досить точним – реакція середовища визначається до 0,1 одиниці pH. Для визначення pH середовища за допомогою приладу Міхаеліса необхідно заздалегідь перевірити реакцію середовища за допомогою лакмусового папірця, щоб знати, яким індикатором та яким рядом ампул із приладу Міхаелісу слід скористатися. Так як для більшості поживних середовищ необхідна нейтральна та слаболужна реакція (pH 7,0-7,2), то з приладу потрібно брати індикатор метанітрофенолу та ряд ампул з pH 6,8-8,2. При стерилізації pH субстрату зазвичай знижується на 0,2 одиниці, тому для створення оптимальних умов для зростання мікроорганізмів перед стерилізацією середовище, що готується, повинно мати pH 7,2-7,4.

Після перевірки реакції середовища по лакмусу та підбору індикатора беруть компаратор, встановлюють у нього пробірки та стандартні ампули з відповідним pH (рис. 55). У другу пробірку першого ряду (№ 2) у компараторі вливають 2 мл досліджуваного живильного середовища; сюди ж додають 4 мл дистильованої води та 1 мл 0,3%-ного розчину обраного індикатора (зазвичай, як уже сказано, метанітрофенолу). У дві крайні пробірки першого ряду № 1 і 3 вливається по 2 мл живильного середовища та по 5 мл дистильованої води. У середню пробірку другого ряду № 5 поміщають лише 7 мл дистильованої води. У два крайніх гнізда другого ряду компаратора № 4 і 6 вставляють ампули зі стандартним розчином з показниками pH, в інтервалі між якими встановлюється реакція середовища.

Розглядаючи пробірки світ через нижній отвір в компараторі на тлі білої матової пластинки, порівнюють забарвлення досліджуваної рідини з забарвленням індикатора. Якщо забарвлення в пробірці з середовищем збігається з забарвленням індикатора в одній з ампул, то величина pH середовища дорівнює значенню pH даної стандартної ампули. Якщо ж колір досліджуваного середовища (у другій пробірці) виявиться світлішим, ніж у стандартній ампулі, то пробірку з середовищем по краплях додають 10%-ний розчин двовуглекислої соди або 0,1 н. розчин їдкого натру, використовуючи для цього мікробюретку. Приливання розчинів, що нейтралізують, по краплях продовжують доти, поки колір у пробірці не зрівняється з кольором в одній з ампул. За кількістю мілілітрів соди або лугу, витраченої на нейтралізацію 2 мл середовища (поміщених у пробірку № 2), неважко підрахувати, скільки мілілітрів нейтралізуючого розчину знадобиться для встановлення рівня pH у всьому обсязі приготування живильного середовища.

У дуже кислих середовищах величину pH визначають за допомогою індикатора пара-нітрофенолу. Розчини індикаторів готують наступним чином.

1. 0,3 г мета-нітрофенолу розчиняють у 100 мл дистильованої води (інтервал значень pH від 6,8 до 8,4).

2. 0,1 г пара-нітрофенолу розчиняють у 100 мл дистильованої води (інтервал значень pH від 5,4 до 7,0).

Встановити приблизне значення pH середовища також можна за допомогою універсального індикатора. Для цього у фарфорову чашку наливають 2-3 мл досліджуваного середовища та доливають 2-3 краплі універсального індикатора. Розмішавши суміш скляною паличкою, порівнюють її колір із забарвленням смуг на кольоровій паперовій шкалі. pH досліджуваного середовища буде таким же, яким вказано у рівнофарбованої смужки кольорової шкали. Ступінь точності визначення pH універсальним індикатором близько 0,5.

Приготування м'ясопептонного агару (МПА)

Агар (по-малайськи «желе») - складна органічна речовина, що отримується з морських водоростей. За хімічним складом він є сумішшю вуглеводів, що відносяться до полісахаридів - похідних галактози - і мають желюючу здатність. Доданий до рідкого середовища агар надає їй таку щільність, що розплавлення її настає лише за температури кипіння. Плавиться агар у воді приблизно за 80-86 °С, твердне при 36-40 °С. Завдяки цьому на агарових середовищах можна вирощувати культури мікробів за будь-якої температури, що допускає їх життя.

М'ясопептонний агар готують із концентрованого м'ясопептонного бульйону. У велику ерленмейєрівську колбу з тугоплавкового скла ємністю до 2 л, забезпечену ватною пробкою, вливають концентрований м'ясопептонний бульйон, додають від 2 до 4% (залежно від сорту) дрібно нарізаного агару і, не закриваючи пробкою, ставлять на слабкий.

М'ясопептонний бульйон необхідно брати з реакцією середовища 7,4, так як при стерилізації pH знизиться на 0,2. Реакцію м'ясопептонного агару можна встановити після того, як відбудеться повне розплавлення. Якщо агар хорошої якості не дає осаду, то після встановлення pH його кип'ятять 12-15 хв, фільтрують через вату і, розлив у колби або пробірки (залежно від потреби), стерилізують в автоклаві 20 хв при 120 °С.

Якщо агар недостатньо очищений, може дати осад. У цьому випадку до стерилізації м'ясопептонний агар слід освітлити. Для цього до розплавленого та охолодженого до 50 °С м'ясопептонного агару додають яєчний білок, змішаний з 30 мл води та збитий до стану піни. На 1 л середовища беруть білок одного курячого яйця. Агар ретельно збовтують з введеним білком і ставлять автоклав на 10 хв при 120°С. Під час кипіння білок згортається і захоплює всі зважені частки. Після автоклавування агар фільтрують через ватно-марлевий фільтр. Для цього беруть скляну вирву великого діаметра, натягують на неї марлю, а зверху кладуть тонкий шар вати. Фільтрувати киплячий агар потрібно швидко і фільтрат до застигання розлити в пробірки 5-10 мл. Стерилізацію середовища проводять у автоклаві, як зазначено вище.

Після стерилізації пробірки з середовищем, що містять по 5 мл агару, ставлять у похилий стан так, щоб агар не торкався пробки. Після застигання одержують «косий» (або скошений) агар. Пробірки з 10 мл агару поміщають у штатив і дають застигнути, отримуючи середовище, розлите на «високий стовпчик». Косий агар зберігати більше 4-7 днів не рекомендується, оскільки він висихає.

М'ясопептонний агар – основне живильне середовище, що використовується при бактеріологічних аналізах у мікробіологічних лабораторіях. Його використовують як у вигляді «простого агару», так: після додавання вуглеводів, готуючи складні диференціально-діагностичні середовища.

Поживним середовищему мікробіології називають середовища, що містять різні сполуки складного чи простого складу, які застосовуються для розмноження бактерій чи інших мікроорганізмів у лабораторних чи промислових умовах.

Поживні середовища готуютьз продуктів тваринного чи рослинного походження. Велике значення має наявність у живильному середовищі ростових факторів, що каталізують метаболічні процеси мікробної клітини (вітаміни групи В, нікотинова кислота та ін.).

Штучні середовищаготують за певними рецептами з різних настоїв або відварів тваринного або рослинного походження з додаванням неорганічних солей, вуглеводів та азотистих речовин.

У бактеріологічній практицінайчастіше використовують сухі живильні середовища, які одержують на основі досягнень сучасної біотехнології. Для їх приготування використовують економічно рентабельну нехарчову сировину: що втратили термін придатності кровозамінники (гідролізин-кислотний гідролізат крові тварин, амінопептид - ферментативний гідролізат крові; продукти біотехнології (кормові дріжджі, кормовий лізин, виноградне борошно, білколізин). часу, зручні при транспортуванні та мають відносно стандартний склад.

За консистенцієюживильні середовища можуть бути рідкими, напіврідкими, щільними. Щільні середовища готують шляхом додавання до рідкого середовища 1,5-2% агару, напіврідкі - 0,3-0,7% агару. Агар є продуктом переробки особливого виду морських водоростей, він плавиться при температурі 80-86 °С, твердне при температурі близько 40 °С і в застиглому стані надає середовищу щільність. У деяких випадках для отримання щільного живильного середовища використовують желатин (10-15%). Ряд природних поживних середовищ (згорнута сироватка крові, згорнутий яєчний білок) є щільними.

За цільовим призначеннямсередовища поділяють на основні, елективні та диференціально-діагностичні.

До основних відносяться середовища, що застосовуються для вирощування багатьох бактерій. Це триптичні гідролізати м'ясних, рибних продуктів, крові тварин або казеїну, з яких готують рідке середовище – поживний бульйон та щільне – поживний агар. Такі середовища є основою для приготування складних поживних середовищ - цукрових, кров'яних та ін, що задовольняють харчові потреби патогенних бактерій.

Елективні живильні середовища призначені для вибіркового виділення та накопичення мікроорганізмів певного виду (або певної групи) з матеріалів, що містять різноманітну сторонню мікрофлору. При створенні елективних поживних середовищ виходять із біологічних особливостей, які відрізняють дані мікроорганізми від більшості інших. Наприклад, вибіркове зростання стафілококів спостерігається при підвищеній концентрації хлориду натрію, холерного вібріону - у лужному середовищі тощо.

Диференціально-діагностичні живильні середовища використовуються для розмежування окремих видів (або груп) мікроорганізмів. Принцип побудови цих середовищ ґрунтується на тому, що різні види бактерій різняться між собою за біохімічною активністю внаслідок неоднакового набору ферментів.

Особливу групу складають синтетичні та напівсинтетичні живильні середовища. До складу синтетичних середовищ входять хімічно чисті речовини: амінокислоти, мінеральні солі, вуглеводи, вітаміни. У напівсинтетичні середовища додатково включають пептон, дріжджовий екстракт та інші поживні речовини. Ці середовища найчастіше застосовують у науково-дослідній роботі та в мікробіологічній промисловості при отриманні антибіотиків, вакцин та інших препаратів.

В останні роки з метою економії поживних середовищ та прискореної ідентифікації деяких мікроорганізмів (ентеробактерії, стафілококи, стрептококи та ін.) застосовуються так звані мікротест-системи (МТС). Вони є полістиролові пластини з лунками, в яких містяться стерильні диференціально-діагностичні середовища. Стерилізацію МТС проводять УФ-опромінення. Мікротест-системи особливо зручні при масових бактеріологічних дослідженнях у практичних лабораторіях.

Вимоги до поживних середовищ

Будь-яке живильне середовище має відповідати наступним вимогам: містити всі необхідні для розмноження мікроорганізмів речовини у формі, що легко засвоюється; мати оптимальні вологість, в'язкість, рН, бути ізотонічною та по можливості прозорою. Кожне живильне середовище стерилізують певним способом залежно від його складу.



При приготуванні живильних середовищ необхідно враховувати потребу мікроорганізмів, що культивуються, в різних елементах живлення. Існують різні класифікації поживних середовищ.

Класифікація поживних середовищ за складом:

1. Прості середовища(МПБ, МПА, желатин, пептонна вода). М'ясо-пептонний бульйон (МПБ) є білковою основою всіх середовищ.

Існує кілька способів приготування МСБ:

а) на м'ясній воді із додаванням готового пептону;

б) на переварах продуктів гідролізу вихідної сировини з допомогою ферментів.

М'ясо-пептонний агар (МПА) отримують шляхом додавання агар-агару (1,5-3%) до МПБ. Якщо МПА розподілений по діагоналі пробірки чи флакона – це скошений агар. Якщо середовище розподілене у пробірці вертикально висотою 5-7 см, це агар стовпчиком. МПА, застиглий у чашках Петрі як штастшки — пластинчастий агар. Якщо середовище має вертикальний шар висотою 2-3 см і діагональний шар такої ж величини, це напівскошений агар.

2. Складні середовищаготуються на основі простих з певними добавками (вуглеводи, кров, жовч, яйця, сироватка, молоко, солі, фактори росту тощо)

Класифікація живильних середовищ за вихідними компонентами:

1. Природні живильні середовища- Це натуральний продукт тваринного або рослинного походження.

Можуть бути:

Рослинні (вихідні продукти - соя, горох, картопля, морква тощо).

Тварини (вихідні продукти - м'ясо, риба, яйця, молоко, тваринні тканини, жовч, сироватка крові тощо).

Змішані (МПА, середовище Левенштейна – Йєнсена тощо).

2. Штучні середовищамістять перероблені природні продукти (м'ясну воду, перевар), речовини, отримані з цих продуктів (пептон, дріжджовий та кукурудзяний екстракти) та різні добавки. Це найбільша і різноманітна за складом найчастіше застосовувана група середовищ. Їх готують за певними рецептами з різних настоїв чи відварів тваринного чи рослинного походження з додаванням неорганічних солей, вуглеводів та азотистих речовин.

3. Синтетичні середовища(відомого хімічного складу) складаються з хімічно чистих сполук у точно встановлених концентраціях (з додаванням вуглеводів, солей, амінокислот, вітамінів тощо). На основі цих середовищ, додаючи до них природні або штучні середовища, одержують напівсинтетичні середовища.

Класифікація поживних середовищ за консистенцією:середовища бувають рідкі(середовища без агару), напіврідкі(З агаром до 1%), щільні(Агарові - 1,5-2,5%). Рідкі середовища найчастіше застосовують для вивчення фізіолого-біохімічних особливостей мікроорганізмів, для накопичення біомаси та продуктів обміну. Напіврідкі середовища зазвичай використовують із зберігання культур, щільні — виділення мікроорганізмів, вивчення морфології колоній, діагностичних цілей, кількісного обліку, визначення антагоністичних властивостей та інших.

Класифікація поживних середовищ за цільовим призначенням:універсальні (загальновживані) та спеціальні.

Універсальні (основні) середовища.Ці середовища використовують для культивування більшості щодо невибагливих мікроорганізмів або застосовують як основу для приготування спеціальних середовищ, додаючи до них кров, цукор, молоко, сироватку та інші інгредієнти, необхідні для розмноження того чи іншого виду мікроорганізмів. До цієї групи належать: МПБ – м'ясо-пептонний бульйон, МПА – м'ясо-пептонний агар, МПЖ – м'ясо-пептонний желатин тощо.

Спеціальні середовища.Призначені виділення і виборчого культивування певних видів мікроорганізмів, які ростуть на простих середовищах.

Розрізняють такі види спеціальних середовищ: середовища збагачення, елективні, диференціально-діагностичні, консервуючі та середовища накопичення.

Середовища збагачення.Багато мікроорганізмів не ростуть на звичайних середовищах, тому для підвищення поживної цінності середовища до неї додають вуглеводи (цукровий бульйон або агар) або білки (сироватковий агар і бульйон, кров'яний агар і бульйон). Кров'яний агар або кров'яний бульйон отримують шляхом додавання до живильного середовища 5-10% підігрітої стерильної дефібринованої крові барана, кролика, коня, людини. Середовище використовується для виділення стрептококів, пневмококів та інших бактерій, а також вивчення гемолітичної активності. Сироватковий бульйон або сироватковий агар отримують шляхом додавання до простих середовищ 15-20% кінської або бичачої сироватки.

2. Елективні (виборчі) середовища.Ці середовища призначені для вибіркового виділення та накопичення мікроорганізмів певного виду з матеріалу, що містить кілька видів мікробів. При посіві на них матеріалу, що містить суміш різних мікроорганізмів, насамперед виявлятиметься зростання того виду, для якого дане середовище буде елективним. Вибірковість середовища досягається шляхом створення умов, оптимальних для культивування певних мікробів (рН, Еh, концентрація солей, склад поживних речовин), тобто. позитивною селекцією. Або шляхом додавання у середовище речовин, що пригнічують інші мікроорганізми (жовч, високі концентрації NаС1, антибіотики та ін.), тобто. негативною селекцією. До цієї групи належать:

Селенітове середовище— є найкращим середовищем збагачення для сальмонел та дизентерійних мікробів Зонне. Селеніт натрію, що міститься в середовищі, стимулює зростання цих бактерій та пригнічує зростання супутньої флори.

Вісмут-сульфіт агармістить солі вісмуту, діамантову зелень. Сальмонели ростуть на цьому середовищі у вигляді колоній чорного кольору. Інші види бактерій на середовищі зростання не дають.

Жовтково-сольовий агар (ЖСА)середовище для виділення стафілококів містить до 10% хлориду натрію, що пригнічує більшість бактерій, що містяться в матеріалі. Крім того, це середовище є і диференціально-діагностичним, так як присутність яєчного жовтка дозволяє виявити фермент лецитиназу (лецитовітелаз), який утворюють патогенні стафілококи. Лецитиназа розщеплює лецитин на фосфорхоліни та нерозчинні у воді жирні кислоти, тому середовище навколо лецитиназопозитивних колоній каламутніє і з'являється опалесцентна зона у вигляді «райдужного віночка».

Жовчний бульйонелективний для сальмонел, розмноження яких стимулює додана 10% жовч, що одночасно гальмує зростання супутніх мікроорганізмів.

Лужний агарабо лужна пептонна водаелективні для холерних вібріонів, лужна реакція середовища (рН 9,0) не перешкоджає зростанню холерних вібріонів, але гальмує зростання інших мікроорганізмів. 3-5 діб. Ж

3. Диференціально-діагностичні середовища.Диференціально-діагностичні середовища застосовують для диференціювання одного виду мікроорганізмів від іншого характером їх ферментативної активності. Склад цих середовищ підбирають з таким розрахунком, щоб чітко виявити найбільш характерні властивості певного виду мікроорганізмів, виходячи з особливостей його обміну речовин.

Середовища виявлення протеолітичної і гемолітичної здатності мікробів, містять у своєму складі білкові речовини: кров, молоко, желатин тощо. Найбільш поширеними середовищами є м'ясо-пептонний желатин (МПЗ) кінська сироватка, що згорнулася, молоко і кров'яний агар (КА).

Середовища для вивчення гліколітичних властивостей включають три основні компоненти: живильна основа (бульйон, агар), субстрат (моно- та дисахара, багатоатомні спирти) та індикатор для виявлення відповідних ферментів. Ферментативне розщеплення субстратів призводить до зсуву рН та зміни забарвлення середовища. Найбільш поширені кольорові середовища з різними вуглеводами (наприклад, із бромтимоловим синім, індикатором ВР). Також поширені середовища Гисса, у яких враховують розбіжності у можливості ферментувати різні вуглеводи з утворенням кислоти, чи кислоти і газу.

Для диференціювання ентеробактерій застосовують пептонну воду з набором різних вуглеводів, індикатором Андреде та поплавцями, що полегшують виявлення газоутворення та допомагають візуально визначити зміну рН, характерну для різних мікроорганізмів. Зокрема, зрушення в кислу сторону викликає почервоніння середовища з реактивом Андріде або пожовтіння при використанні середовища з бромтимоловим синім, тоді як при залужуванні індикатор Андреде і синій бромтимоловий не змінюють колір середовища. Наприклад, виділення патогенних бактерій з кишечника застосовують середовища, які дозволяють диференціювати патогенні мікроорганізми від постійних жителів кишечника — мікроорганізмів, що розкладають лактозу.

Таким середовищем є середовище Ендо. Основними компонентами середовища Ендо є МПА, лактоза та основний фуксин, знебарвлений сульфітом натрію. Вихідне живильне середовище пофарбоване у світло-рожевий колір. При зброджуванні лактози утворюється ацетальдегід, який реагує з сульфітом і, що вивільнився при цьому, фуксин забарвлює колонії в яскраво-червоний колір. Тому кишкова паличка, яка зброджує лактозу, при зростанні на цьому середовищі утворює червоні колонії з металевим блиском, а сальмонели та шигели безбарвні, тому що вони не зброджують лактозу.

4. Середовище накопичення,у яких відбувається швидке зростання певних видів мікроорганізмів.

5. Консервуючі (транспортні) середовища.Призначені для збереження мікроорганізмів під час транспортування до місця дослідження. Ці середовища містять добавки, що попереджають розмноження і загибель мікробів, що сприяє збереженню їх життєздатності. Найбільше застосування знайшли гліцеринова суміш (середа Тига), фосфатно-буферна суміш та середовища Карі-Блейра, Амієса (з активованим вугіллям та без активованого вугілля), Стюарта та ін.

Стерилізація живильних середовищ.

Всі живильні середовища незалежно від їхнього призначення розливають у чистий посуд і стерилізують. Більшість серед стерилізують автоклавуванням, але при різних режимах залежно від їх складу.

1. Синтетичні середовища та всі агарові середовища, що не містять у своєму складі нативного білка та вуглеводів, стерилізують 15-20 хв в автоклаві при температурі 115-120°С та тиску 1-1,5 атмосфери.

2. Середовища з вуглеводами та молоком (до складу якого входить лактоза), поживний желатин стерилізують плинною парою при температурі 100°С дробно або в автоклаві при 112°С і при тиску до 1 атмосфери.

3. Середовища, до складу яких входять білкові речовини (сироватка крові, асцитична рідина), знешкоджуються тиндалізацією або фільтруванням.

4. Для стерилізації живильних середовищ, що містять у своєму складі нативні білки, користуються фільтрацією через мембранні фільтри Зейтца.

Для контролю стерильності середовища після стерилізації поміщають термостат при 37°С на 3-5 діб. Рідкі середовища повинні залишатися прозорими, а на поверхні та в товщі щільних поживних середовищ не повинні з'являтися ознаки зростання. Крім контролю стерильності, виробляють хімічний контроль готових середовищ, який полягає в тому, що в декількох зразках кожної серії визначають рН, кількість загального та амінного азоту та хлоридів.

Існує також біологічний контроль середовищ. У цьому випадку кілька зразків середовища засівають лабораторною культурою того мікроба, для якого приготоване середовище, та вивчають характер його зростання. Тільки після того, як середовища витримали контроль, їх можна використовувати за призначенням.

За призначенням живильні середовища поділяють такі основні категорії.

Універсальні- Середовища, на яких добре ростуть багато видів патогенних та непатогенних бактерій. До них відносяться: м'ясо-пептонний бульйон (МПБ = м'ясна вода + 1% пептону + 0,5% NaCl), м'ясо-пептонний агар (МПА = МПБ + 2-3% агару).

Диференційно-діагностичні- середовища, що дозволяють відрізняти одні види бактерій від інших з їхньої ферментативної активності або культуральних проявів. До них відносяться середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса та багато інших.

Селективні(синоніми: виборчі, елективні, збагачувальні) - середовища, що містять речовини, що використовуються мікроорганізмами певних видів і не сприяють або навіть перешкоджають зростанню інших мікроорганізмів. Селективні середовища дозволяють спрямовано відбирати з досліджуваного матеріалу певні види бактерій. Сюди відносяться середовища Мюллера, селенітова, Рапопорт, 1%-на пептонна вода та ін.

Диференційно-селективні- середовища, що поєднують у собі властивості диференціально-діагностичних та селективних середовищ. Вони використовуються, зокрема, для прискорення виявлення та ідентифікації бактерій, що відносяться до великої кількості широко поширених видів ентеробактерій та псевдомонад (середовища Сиволодського).

Спеціальні- Середовища, спеціально приготовані для отримання зростання тих бактерій, які не ростуть або дуже погано ростуть на універсальних середовищах. До них відносяться середовища Мак-Коя-Чепіна (для отримання зростання збудника туляремії), кров'яний МПА (для отримання зростання патогенних стрептококів), середовище Левенштейна-Ієнсена (для виділення збудника туберкульозу) та ін.

Синтетичні- Середовище суворо певного хімічного складу, що є розчинами неорганічних солей з додаванням хімічних сполук, які служать джерелом вуглецю або азоту. Прикладом такого синтетичного середовища є мінімальне середовище М-9, в якому джерелом енергії та вуглецю є глюкоза, а азоту – NH4C1. Синтетичні середовища можуть бути більш складного складу з включенням різних амінокислот, основ і вітамінів.

Напівсинтетичні- синтетичні середовища, до яких додають будь-який продукт природного походження, наприклад, сироватку крові. Існує багато різних варіантів поживних середовищ, сконструйованих з урахуванням потреб відповідних видів бактерій та діагностичних цілей.

Асинхронний електродвигун А4 призначений для приводу механізмів, що не вимагають регулювання частоти обертання (вентиляторів, димососів, насосів). Відмінні риси двигунів серії А4 та їх характеристики ви можете дізнатися на